197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
197 047 28 restrikciós endonukleáz (például a Bel 1, Sau 3A) által felismerhető szekvenciát. A kapott plazmád fragmenst a kapcsolódó linkerre jellemző restrikciós endonukleázzal (például Bel I) hasítjuk, és ezt követően EcoR I enzimmel (a pBR 322 tartalmaz egy olyan EcoR I helyet, amely a ß-laktamäz kifejezést szabályozó szekvenciájának szomszédságában helyezkedik el). A kapott dezoxi-ribonukleinsav-fragmens, például az EcoR I—Bel 1 dezoxi-ribonukleinsav-fragmens tartalmazza a ß-laktamäz kifejezést szabályozó szekvenciáját (ApPr), és a hozzákapcsolt linkért. A fragmens poliakrílamíd gélclektroforézissel izolálható. Másrészről a HuLylFN cDNS beépített szakaszt kihasítjuk az ezt tartlamazó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav molekulából (4d/ pont), például Pst I restrikciós endonukleázos emésztéssel. Az izolált HuLylFN cDNS szakaszt egy másik restrikciós endonukleázzal (vagy, ha szükséges, két másik restrikciós endonukleázzal és ezt követő religálással) tovább hasítjuk a szignálpeptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia eltávolítására. A kapott, érett HuLylFN cDNS egy ragadós véggel rendelkezik, amely komplementer a fentiekben ismertetett ApPr dezoxi-ribonukleinsav-fragmensre (például ez egy Sau 3A ragadós vég). Az érett HuLylFN cDNS és az ApPr dezoxi-ribonukleinsavfragmenseket ligázzal ismert módon (3d/ pont) összekapcsoljuk. Az összekapcsolást követően a megfelelő leolvasási fázis biztosítására olyan terméket kell kapnunk, amelyben az érett cDNS első kodonját egy ATG kodon előzi meg. A kapott hibrid dezoxi-ribonukleinsav tartalmazza a ß-laktamäz kifejezést szabályozó szakaszát, az ATG transzlációs start kodont, a teljes HuLylFN-t meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, és két olyan restrikciós endonukleázzal kapott véget (például EcoR I és Pst I végek), amelyek alkalmasak a hibrid dezoxi-ribonukleinsav beépítésére a hasonlóképpen hasított pBR 322 plazniidba. A kapott hibrid plazmiddal E. coli HB 101 sejteket transzformálunk HuLylFN aktivitással rendelkező nagy mennyiségű polipeptid szintézisének céljából. 27 7) A HuLylFN-specifikus rekombináns dezoxi-ribonukleinsa vakat tartalmazó kiónok tenyésztése A találmány szerint transzformált gazdasejteket felhasználjuk a HuLylFN aktivitású polipeptidek termelésére. A polipeptidek termelésének módszerét alapvetően az jellemzi, hogy a transzformált sejtet, nevezetesen a transzformált E. coli-t folyékony halmazállapotú táptalajban, felhasználható szénforrás, nitrogénforrás és szervetlen sók jelenlétében tenyésztjük. Szénforrásként különböző vegyületeket használhatunk. Előnyös szénforrások a felhasználható szénhidrátok, például a glükóz, maltóz, mannit vagy laktóz, vagy egy acetátsó, ezeket önmagukban vagy megfelelő keverékként használjuk. Nitrogénforrásként előnyösen például aminosavakat, például kazaminavat, peptideket és proteineket, és ezek emésztett termékeit, például triptont, pepíont vagy hűskivonatot, továbbá élesztőkivonatot, malátaki' vonatot, kukoricalekvárt vagy ammóniumsókat, például ammónium-kloridot, ammónium-szulfátot vagy ammónium-nitrátot használunk, önmagukban vagy megfelelő keverékként. Szervetlen sóként például nátrium-, kálium-, magnézium- vagy kalciumsót, például szulfátokat, kloridokat, foszfátokat vagy karbonátokat használunk. A tenyésztéshez használt táptalaj növekedést elősegítő anyagokat és/vagy a HuLyIFN-specifikus ickombináns dezoxi-ribonukleinsav elvesztését megakadályozó szelekciós nyomást biztosító anyagokat is tartalmazhat. A növekedést elősegítő anyagok közül megemlítjük például a nyomelemeket, például a vasat, cinket, mangánt stb., vagy egyes aminosavakat. A HuLylFN aktivitású polipeptidet meghatározó génen kívül a találmány szerinti rekombináns dezoxi-ribonukfeinsavak előnyösen antibiotikum rezisztenciát meghatározó gént is tartalmaznak, például ampicillin és/vagy tetraciklin rezisztenciát okozó gént. Ebben az esetben a tenyészláhez antibiotikumot adunk, ebben az esetben a rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó sejtek túlélők lesznek és növekszenek, míg azok a sejtek, amelyek elvesztették a rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat vagy más, antibiotikumra érzékeny, a tenyészetet fertőző mikroorganizmusok nem növekszenek. A tenyésztést ismert módszerekkel végezzük. A tenyésztési körülményeket, például a hőmérsékletet, a táptalaj pl-l-ját és a fermentációs időt úgy választjuk meg, hogy a legnagyobb mennyiségű interferonszerű polipeptid termelődjön. Egy kiválasztott E. coli törzset előnyösen például levegőztetett fermentációs körülmények között süllyesztett tenyészetben, rázás vagy keverés közben tenyésztünk 20 °C és 40 *C közötti, előnyösen 30 °C hőmérsékleten, 4-9, előnyösen 7 pl 1-n. A tenyésztést 4-20 órán át, előnyösen 8-12 órán át végezzük. A tenyésztést követően intracellulárisan interferonszerű polipeptidek halmozódnak fel. 8) Az interferon-aktivitással rendelkező polipeptidek izolálása és tisztítása _ A találmány szerinti humán lymphoblastoid interferonokat a tenyészléből úgy' izoláljuk, hogy kiszabadítjuk a polipeptideket a transzformált gazdasejtekből és tisztítjuk. Miután az E. coli transzformált sejtjeit megfelelő sejtsűrűségig tenyésztettük, a kifejezett polipeptid kinyerésének első lépéseként felszabadítjuk a terméket a sejt belsejéből. Úgy járunk el, hogy a sejteket egy detergenssel, például nátrium-dodecil-szulfáttal vagy Triton-nal kezelve lizáljuk. Feltárhatjuk a sejteket mechanikus erőkkel is, például nyíróerőkkel, például X-prést vagy French-prést használva, vagy üveg- vagy alumíniumporral rázatva. A kapott polipeptid-keveréket Ismert módon dúsítjuk humán Ly-interferonra, például ammónium-szulfátos vagy triklór-ecetsavas kicsapással, gélelektroforézissel, dialízissel, kromatográfiával, például ion-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 85 15
