197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
29 197 047 30 cserés kromatográfiával, nagyságszelektáló kromatográfiával vagy reverz fázisú, nagynyomású kromatográfiával stb. Az előtisztított termék végső tisztítását például antiíest-affinitás-kromatográfiával végezzük. Alapjában véve a tisztítási lépéseket Staehelin és munkatársai szerint végezzük (51), amelyet a humán leukocita interferon tisztítása kapcsán írnak le. A humán LyIFN izolálását és tisztítását például az alábbiak szerint végezzük: 1) Az E. coli sejteket lizáljuk, 2) a nem-proteines anyagok részbeni eltávolítását polietilén-imines kezeléssel végezzük, majd 3) a polipeptideket kicsapjuk úgy, hogy az oldatot ammónium-szulfáttal telítjük, 4) megfelelő pufferral szemben dializálunk, 5) az oldatot DEAE-cellulóz oszlopon kromatografáljuk, 6) monoklónozott antitestekből készült oszlopon affinitás-kromatográfiát végzünk, végül 7) megfelelő SephadexR-oszlopon molekulanagyság szerinti elválasztást végzünk. Megfelelően tiszta termék előállítására további tisztítási lépések szükségesek, például kation- vagy anioncserés kromatográfia, hidroxil-apatiton való adszorpció, reverz fázisú nagynyomású kromatográfia stb. Másrészről a fentiekben ismertetett lépések közül egyik vagy másik kihagyható, ha lehetséges, vagy más lépéssel helyettesíthető. A találmány szerinti eljárással a polipeptidek fragmenseit és származékait is előállíthatjuk, például proteolitikusan hasított polipeptideket, teljesen vagy részben védett, például aciíezett, szililezett és különösen glikozilezett polipeptideket, továbbá ezek sóit. Ezeket ismert eljárásokkal állítjuk elő. A találmány különösen a dezoxi-ribonukleinsavakra és a polipeptidekre vonatkozik, ezeket tiszta alakban állítjuk elő. Vonatkozik továbbá a találmány a transzformált gazdasejtekre, polipeptidekre és ezeknek a példákban megadott módon való előállítására. A találmány szerint előállított polipeptideket és ezek megfelelő származékait, például a glikozilezett termékeket az interferonokkal analóg módon, vírusos fertőzések, az emberi test tumoros és rákos elváltozásainak kezelésére használjuk, előnyösen más vírusellenes, tumor- vagy rákellenes szerekkel együtt, előnyösen olyan gyógyszerészeti készítmények alakjában, amely az aktív összetevőt szervetlen vagy szerves, szilárd vagy folyékony halmazál lapotú kiegészítő anyagokkal együtt hatásos menynyiségben tartalmazza. Előnyösen olyan gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyagokat használunk, amelyek parenterális adagolásra alkalmasak, A találmány szerinti farmakológiailag aktív vegyületcket előnyösen parenterális, például intramuszkuláris vagy intravénás adagolásra alkalmas készítmények vagy infúziós oldatok alakjában használjuk. Ezek az oldatok előnyösen izotóniás, vizes oldatok vagy szuszpenziók, amelyeket használat előtt állítunk elő, például az aktív összetevőt önmagában vagy gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal együtt tartalmazó, fagyasztva szárított készítményekből. A gyógyszerészeti készítményeket sterilizálhatjuk és/vagy kiegészíthetjük például konzerválószerekkel, stabilizálókkal, nedvesítőszerekkel, és/vagy emulziftkálószerekkel, az oldást elősegítő anyagokkal, az ozmotikus nyomást szabályozó sókkal és/vagy puffcrokkal. A találmány szerinti gyógyszerészeti készítményeket, amelyek adott esetben további farmakológiailag értékes anyagokat tartalmazhatnak, ismert módon ál lítjuk elő, például úgy, hogy az összetevőket oldjuk vagy fagyasztva szárítjuk. A készítmények az aktív összetevőt 0,1% és 100%, előnyösen 1% és 50% közötti mennyiségben, a fagyasztva szárított tennék esetén 100 % -or, mennyiségben tartalmazzák. A betegség természetétől és a kezelendő beteg állapotától függően a készítményeket általában például intramuszkulárisan adagoljuk 1-3 alkalommal naponta, 10s és 107 egység közötti mennyiségben. A továbbiakban példákkal szcinléllctjük a találmány szerinti eljárást. A példákban megadottak az oltalmi kört nem korlátozzák. A példákban az alábbi rövidítéseket használjuk: EtBr: etidium-bromid BSA: marhaszérum albumin D1T: 1,4-ditio-treítol (1,4-dimerkapto-2,3-bután-diol) EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav SDS: nátrium-dodecil-szulfát TNE 100 mM nátrium-kloridot, 50 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH - 7,5) és 5 mM EDTA-t tartalmazó oldat. Trisz: trisz-(hidroxi-metil) - amino -metán Trisz-bidrogén-klorid: a trisz mono-hidrogén-kloridja. 1. példa A HuIFN mRNS-re dúsított poii-fA)-ribonukleinsav izoldldsa (1, ábra) a) A Namalwa sejtek indukdldsa A Namalwa sejteket 10% marhaszérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajban növesztjük 37 °C hőmérsékleten. Amikor a sejtek sűrűsége a ml-enkénti 3X105 sejtet eléri, 800 g-n 10 percen át szobahőmérsékleten centrifugáljuk a szuszpenziót. Az összegyűjtött sejteket 200 ml 0,027% glutamint, ml-enként 200 egység penicillint és ml-enként 50 pg sztreptomicint tartalmazó táptalajban szuszpendáljuk. 90 percen át 37 °C hőmérsékleten Ncwcastlc-vfrussal (NDV 110) inkubáljuk a sejteket, a vírusok és a sejtek aránya 190 haemagglutinációs egység/106 sejt. Friss táptalaj adagolásával l,3xlOÄ sejt/ml sűrűségre hígítjuk a szuszpenziót, majd 34 °C hőmérsékleten percenként 100-at forduló rázőgépen rázzuk. 12 óra múlva 6X109 sejtet összegyűjtünk és 50 ml foszfát-puíferral kiegészített sóoldatban szuszpendáljuk. A sóoldat (PBS) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 16
