197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
21 197 047 22 összes védőcsoportjainak lehasftását ismert módszerekkel végezzük. Például a 2 - ciano - etil - csoportot (R3) alkalikus kezeléssel hasíthatjuk, az R, monometoxi-triül-csoportot 80%-os ecetsavas reakcióval, és az Rj 2-klór-fenil-csoportot tetrabutil - ammonium - fluoridos reakcióval hasítjuk. Használhatunk az irodalomban ismert, más módszereket is. A szintézis egyes lépéseit a 2. ábrán mutatjuk be. Az előállított 13-tagű oligo-dezoxi-nukleotid prímért ismert kromatográfiás módszerekkel tisztítjuk. Például ügy járunk el, hogy DEAE-Sephadex kromatográfiát és/vagy nagy felbontású folyadékkromatográfiát végzünk. A prímért ügy jelöljük 5’P32-jelzéssel, hogy a következő hibridizációs eljárás során a hibridizált próbát detektálhassuk. A jelzést úgy végezzük, hogy a szintetizált prímért jelzett foszforilezőszerrel, például [gamma-P3J-]ATP-vel jelöljük, a jelölést T4 polinukleotid kinázzal végezzük, előnyös pufferelegyben. A P32-jelzett prímért tartalmazó oldatot proteinmentesítésse! (például fenollal) és kromatográfiával (például Sephadex kromatográfiával) vagy poli-akrilamid gél-elektroforézissel tisztítjuk. Ha szükséges, a termék nukleotid-szekvenciáját kétdimenziós homokromatográfiával bizonyítjuk. Az ld) pontban megadottak szerint előállított LyIFN mRNS-re töményített poli-(A)-rlbonukleinsavat használjuk templátként, egy IFN-a- és INF-ß-specifikus cRNS-próba előállítására. Úgy járunk el, hogy a cDNS szintézisére gyakorlatilag a 2a) pontban megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy az oligo-(dT) helyett primerként 5’-jelzetf szintetikus oügo-dezoxi-nukleotidot használunk. A jelzett cDNS terméket például fenollal proteinmentesítjük és etanolos kicsapással gyűjtjük össze. További tisztítást végezhetünk például a cDNS termék poli-akrilamid gélelektroforézisével. A terméket autoradiográfiával vizsgáljuk. Az indukált sejtekből izolált poli-(A)-ribonuk!einsavra specifikus egyszálú dezoxi-ribonukleinsav csíkot nem tudunk kimutatni abban a termékben, amelyet a nemindukált sejtekből származó poli(A)-ribonukleinsawal állítottunk elő és extraháltunk a gélről. A termék nagyságát például ismert hosszúságú jelzett dezoxi-ribonukleinsav kontroílokkal összehasonlított relatív mobilitásából állapítjuk meg. Az előállított termék egy P32-jelzett humán LyIFN-a és LyIFN-ß specifikus cDNS-próba. c) A lymphoblastoid IFN cDNS-í tartalmazó klánok izolálása A túlélő és tetraciklinnel kiegészített agaron (lásd 3e) pontot) növekvő telepeket lymphoblastoid interferon cDNS-t tartalmazó kiónokra vizsgáljuk. Ezt ín situ, az előzőekben (4a/ pont) ismertetett telep-hibridizációs módszerrel végezzük. A transzformáns telepeket niirocellulóz szűrőkre juttatjuk, és további agarlemezekre replikázva kontrolltelepeket is növesztünk. A szűrőn levő telepeket lizáljuk, dezoxi-ribonykleinsavukat denaturáljuk, és in situ fixáljuk a szűrőkön. (36) A hibridizációs eljárás előtt a szűrőkön levő denaturált dezoxi-ribonukleinsavat előnyösen idegen forrásból származó dezoxf-tibonukleirjsav-keverékkel előbibridizáljuk abból a célból, hogy gyengébb hátteret kapjunk, és hogy a nemspecifikus hibridizáiódó helyeket telítsük. Ezután az előzőekben (4b/ pont) megadott módon előállított, radioaktívan jelzett cDNS-molekuiákkai hibridizáljuk a szűrőre kötött dezoxi-ribonukleinsavat, amelyeket előzőleg ásványi olajjal fedtünk be. Miután a szűrőket megtisztítjuk az ásványi olajtól és más szenynyeződésektől, a hibridizáció eredményeit X-sugárzásérzékeny filmet használva, autó radiográfiás analízissel értékelhetjük. A röntgensugár-érzékeny filmen pozitív eredményt adó telepeket a kontroll lemezekről izoláljuk és tovább vizsgáljuk. Előnyösen úgy járunk el, hogy a transzformált telepek csak egy részét juttatjuk a nitroceliulőz szűrőkre. A további telepeket az alábbiakban (4d/ pont) ismertetett eljárásokban használjuk további vizsgálatokhoz. A nítrocellulóz szűrőkön fixált dezoxi-ribonukleinsavat például olyan előhibridizációs eleggyel kezeljük, amely denaturált dezoxi-ribonukleinsavat, például denaturált borjű-thymus dezoxi-ribonukleinsavat, marhaszérűm albumint, Ficoll-t és polivinil-pirrolidont tartalmaz, majd ezután hibridizáljuk a 4b) pontban megadottak szerint radioaktívan jelzett cDNS-próbávai, mégpedig paraffinolaj alatt standard hibridizációs eljárással (36). A hibridizáció befejezését követően kloroformmal, majd ezután náírium-dodecil-szulfátot és kis koncentrációban sót tartalmazó puffénál mossuk a szűrőket, a paraffin olaj és a nemhibridizált cDNS eltávolítására. A szűrőket autoradiográfiás vizsgálatra röntgensugárzásra érzékeny filmmel fotózzuk. A hibridizált telepek pozitív foltot adnak, és a kontroll lemezekről izolálhatok. Az azonosított telepek a cDNS-próbára komplementer rekombináns dezoxi-ribonukleinsav szakaszt tartalmaznak, azaz olyan dczoxi-ribonukleinsav-szegmenseket, amelyek megfelelnek a humán lymphoblastoid géneknek vagy fragmenseknek. Mivel a transzformált sejtek primer telepei esetenként többféle rekombináns dezoxi-ribonukleinsavmolekulát tartalmaznak, a pozitívan hibridizálódó telepekből izoláljuk a hibrid plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, és E. coli HB 101 sejteket transzformálunk a 3s) pontban megadottak szerint eljárva. A hibrid plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat például az alábbiak szerint eljárva izoláljuk. Először az azonosított telepeket megfelelő táptalajban, például triptont tartalmazó táptalajban tenyésztjük, a plazmidot nem tartalmazó sejtek eliminálására, tetraciklin jelenlétében. A túlélő sejteket összegyűjtjük, megfelelő pufferban szuszpendáljuk és úgy tárjuk fel őket, hogy a kromoszóma a sejten belül maradjon. Részletesebben szólva, úgy járunk el, hogy lizozimot, etilén-diamin-tetraecetsavat és egy nem ionos detergenst, például Triton-t adagolunk. Ezután a sejtíörmeléket és a kromoszómái'^ dezoxiribonukleinsavat centrifugálássa! elkülönítjük. A felül úszót például fenollal proteinmentesítjük, és a ribonukleinsavat ribonukleázzal, például ribonukleáz A-vaí hasítjuk. A hibrid plazmid dezoxi-ribonukleinsavat a ribcnukleinsav-fragmensektől polie5 10 15 20 25 30 35 40 x*5 50 55 60 55 12
