197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
23 197 047 24 tilén-glikolos kicsapással különítjük el, és etanolból való kicsapással tisztítjuk. A kísérletek ezen fázisában az izolált hibrid dezoxi-ribonukleinsav restrikciós térképét megfelelő restrikciós endonukleázokkal való hasítással meghatározzuk. A hasítást előnyösen a pBR 322 plazmid linearizálására használt enzimmel végezzük, azon a helyen, ahol a kétszálú cDNS beépül (lásd 3b/ pont). A restrikciós fragmensek nagyságát meghatározzuk, például oly módon, hogy ismért hosszúságű dezoxi-ribonukleinsav kontrolihoz viszonyítjuk, agarózgélen, elektroforetikus mobilitásukat. Az izolált hibrid dezoxi-ribonukleinsavak mindegyikével E. coli HB 101 sejteket újratranszformálunk, és megfelelő, tetraciklint tartalmazó, agaros táptalajon tenyésztjük (lásd 3e/ pont). Az újratranszformált sejtekből fejlődött egyes telepeket izoláljuk, és a bennük levő hibrid plazmid dezoxi-ribonukleinsavat a fentiek szerint izoláljuk. Az izolált hibrid plazmid dezoxi-ribonukleinsavat ismét restrikciós enzimmel analizáljuk, és a beépült cDNS teljes vagy részleges nukleotid-szekvencia analízisét is elvégezzük abból a célból, hogy a továbbiakban felhasználható hibrid dezoxi-ribonukleinsavakat kiválaszthassuk. A részleges szekvenciaanalízis továbbá tisztázza az a kérdést is, hogy a beépült interferon cDNS szegmensek megfelelnek-e a humán lymphoblastoid IFN-a- vagy IFNP-géneknek. Jelenleg több módszer ismeretes a dezoxi-ribonukleinsav-molekulák szekvenálására. A Sanger (40) által kifejlesztett szintézismódszerek szerint dezoxi-ribonukleinsav polimerázokat használunk egy egyszálű dezoxi-ribonukleinsav templát komplementer szálának szintézisére, a szintézis során restrikciós endonukleázos emésztéssel kapott, radioaktívan jelzett dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket használunk primerként. Választhatjuk azonban a Maxam és Gilbert szerinti (41) szerinti kémiai dezoxi-ribonukleinsav szekvenáló módszert is. E módszer szerint a szekvenálandó dezoxi-ribonukleinsavat a molekula végén jelezzük, a négy bázis mindegyikénél négy különböző reakcióban részlegesen hasítjuk, és a terméket például denaturáló körülmények között gél-elektroforézissel frakcionáljuk, a molekulák nagysága szerint. A dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát a radioaktív csíkok elhelyezkedéséből állapítjuk meg. A teljes nukleotidszekvencia meghatározására kiválasztunk egy dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst, és kiválasztunk egy olyan restrikciós endonukleázt, amely a dezoxi-ribonukleinsavat ezen a szakaszon képes hasítani. Maxam és Gilbert módszere szerint a hasítástól jobbra, illetve balra eső 100-150 bázis egy kísérletben meghatározható. Például úgy járunk el, hogy az izolált hibrid dezoxi-ribonukleinsavat megfelelő restrikciós endonukleázzal, például Pst I, EcoR I, Bgl 11, Pvu II vagy Alu I enzimmel kezeljük, azon a helyen, amely a cDNS beépült szakaszon belül helyezkedik el. A kapott dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket terminálisán jelöljük, például fgamma-P32]-ATP- vel, polinukleotid-kináz jelenlétében, és oly módon hasítjuk egy másik restrikciós endonukleázzal, hogy a kétszálú dezoxi-ribonukleinsavnak csak egy szála maradjon terminálisán jelzett. A megfelelő dezoxiribonukleinsav-fragmenseket például poli - akrilamíd -gél - elektroforézíssel izoláljuk. Ezután a dezoxi - ribonukleinsav - fragmenseket bázis - specifikus hasítási reakcióknak vetjük alá, Maxam és Gilbert szerint (41). A terméket elektroforézissel, például denaturáló körülmények között, például 7 mól karbamid jelenlétében végzett poli-akrilamid gél-elektroforézissel frakcionáljuk, és a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket au torad iográfiásan figyeljük meg. d) Lymphoblastoid interferon cDNS-t tartalmazó további telepek azonosítása Ahogy azt a 4c) pontban megadtuk, a transzformáns telepek egy részét nitrocellulóz szűrőkre juttatjuk, és fixált dezoxi-ribonukleinsavukat in situ telep-hibridizációval vizsgáljuk, rádioaktívan jelzett cDNS-próbával, például egy interferonra specifikus cDNS-próbával. A pozitívan hibridizálódó telepek rekombináns dezoxi-ribonukleiasavát felhasználva olyan további telepeket választunk ki, amelyek interferon vagy ezzel rokon szekvenciájú dezoxiribonukleinsavszakaszt hordozó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-molekulákat hordoznak. A fenti célra az azonosított telepek mindegyikének plazmid dezoxi-ribonukleinsavát (amelyek megfelelnek a különböző interferon géneknek vagy génfragmenseknek), amelyeket az első vizsgálat során választunk ki (4c/ pont), a fentiek szerint eljárva izoláljuk, és restrikciós endonukleázzal úgy hasítjuk, hogy' megkapjuk az interferon cDNS beépült szakaszt vagy ennek egy részét. Miután a plazmid fragmenseket 5’-terminálison jeleztük, és a megfelelő dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket (a radioaktívan jelzett interferont meghatározó szakaszt vagy ennek egy részét tartalmazzák) izoláljuk, például poliakrilamid gél-elektroforézissel, az anyagot önmagában vagy keverékként felhasználjuk. Hibridizációra a transzformáns telepeket (lásd előbb) nitrocellulóz szűrőkre juttatjuk és lizáljuk. Dezoxiribonukleinsavukat denaturáljuk, in situ fixáljuk a szűrőkre, és interferon-specifikus, radioaktívan jelzett dezoxi-ribonukleinsav-fragmensekkel híbridizáljuk Grunstein és Hogness (36) szerint. A hibridizálódó telepeket autoradiográfiásan figyeljük meg, és a kontroll lemezről izoláljuk. A rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-molekulákat tartalmazó, azonosított telepeket úgy tekinthetjük, hogy azok a használt próbával azonos vagy ahhoz hasonló cDNS szakaszt tartalmaznak. A vizsgálattal olyan további telepeket izolálhatunk, amelyek lymphoblastoid lFN-cx- vagy lFN-ß-interfcron géneket vagy génfragmenseket tartalmaznak. Az azonosított telepek plazmid dezoxi-ribonukleinsavát izoláljuk, restrikciós analízissel és részleges vagy teljes szekvencia-analízissel az előzőekben megadott szerint (4c/ pont) jellemezzük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
