197045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bifunkcionális rekombináns DNS klónozó vektor és a vektor transzformánsainak előállítására
11 I 3/ UHU Kalci um-klorid- dihidrát, 3,68%-os oldat 80,2 ml Prolin, 20%-os oldat 15,0 ml TES puffer (0,25 mól, pl I 7,2)* 100,0 ml Nátrium-hidroxid (In oldat) 5,0 ml Élesztőkivonat (Oxoid), 10%-os oldat 50,0 ml Nyomelem oldat** 2,0 ml *A TES puffer összetétele a következő: 10 mM TRISZ-HC1, pH 7,2. (trisz[hidroximetil] -amino-metán) 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) 0,05 M nátirum-klorid. **A nyomelem oldat az alábbi összetétel J: Cink-klorid 40 mg Réz(lI)-klorid-dihidrát 10 mg Dinátrium-tetraborát-dekahidrát 10 mg Foszfor-molibdénsav 10 mg Vas(III)-kIorid-hexahidrát 200 mg Mangán(ll)-klorid-tetrahidrát 10 mg Desztillált víz 1000 ml (végtérfogat). Az R2YE ferdeagarokat beoltjuk a Streptomyces lividans pIJ41 [NCAIM B(P) 000258] spóráival, majd 6 napon át 28 °C hőmérsékleten tenyésztünk. A kinőtt tenyészettel 200 ml YEME jelű táptalajt oltunk, a táptalajt 1000 ml-es lombikban sterilezzük 20 percen át 121 °C hőmérsékleten. A táptalaj az alábbi összetételű: Szacharóz 34% Magnézium-klorid-hexahidrát 0,102% Glükóz 1,0% Élesztőkivonat (Difco)+ 0,3% Pepton (Difco) 0,5% Malátakivonat (Oxoid) 0,3% +Difco Laboratories, Detroit, USA. A táptalaj pH-ja 7,0. A tenyészeteket 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 48 órán át, olyan rázógépen, amely percenként 200-at fordul. B. A pIJ41 plazmid izolálása Az 1. példa A. pontja szerint előállított tenyészetet Sorvall RC5 centrifugában 10 percen át, 25'C hőmérsékleten centrifugáljuk. A rotor percenként 8000-et fordul. A sejteket 200 ml 10%-os steril szacharóz oldatban szuszpcndáljuk, és a fentiek szerint ismét centrifugálunk. A micéliumokat ezután 8 ml alábbi összetételű lizozim oldatban szuszpendáljuk: 100 ml 10,3% szacharózt tartalmazó oldathoz hozzáadunk 1 ml 2,5%-os káliumszulfát, 1 ml 0,5%-os kálium-dihidrogén-szulfát, 0,1 ml 2,5 mólos magnézium-klorid, 1 ml 0,25 mólos kalcium-klorid oldatot, 2,5 ml, 1 mólos Irisz-HCl, pH 8,0 puffert, 4 ml 50% glükóz oldatot és 100 mg lizozimot (Reanal, Budapest). A micéliumokat 60 percen át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 8 ml 50 °C hőmérsékletű litikus elegyet adunk hozzá. A Sitikus elegyet a következőképpen készítjük el: 10 ml 5 mólos nátriumlidroxidhoz 20 ml 10%-os nátrium-lauril-szulfátot, 25 ml 0,25 mólos etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA) és 45 ml desztillált vizet adunk. A litikus elegy hozzáadása után 15 percen át 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk a kapott protoplaszt szuszpenziót, majd fenol és kloroform 1:1 arányú elegyéből 16 ml-t adunk hozzá. Erőteljesen leveijük az elegyet, majd a két fázist centrifugálással elválasztjuk (10 perc, 10000 fordulat/perc). A i Ízes fázist elkülönítjük, éterrel háromszor extraháljuk, majd 80 ml 96%-os etanolt adunk hozzá. A kivált plazmid DNS-t centrifugálással elkülönítjük (Sorvall RC5 centrifuga, 5 perc, 10000 fordulat/perc). A felülúszót eltávolítjuk, a DNS-t exikátorban szárítjuk és ezután 7 ml TE oldatban oldjuk. A TE oldat előállítására 250 ml 0,01 mólos Trísz-HCl, pH 7,5, púfferhoz hozzáadunk 1 ml 0,25 mólos vizes EDTA oldatot. A 7 ml DNS oldatban 7,5 g cézium-kloridot (SÉRVA) oldunk, az elegyhez 0,5 ml, milliliterenként 10 mg etidiumbromidot tartalmazó oldatot adunk, majd ezt követően T865.1 rotorban, 15 °C hőmérsékleten, 48 órán át 39000 percenkénti fordulatszámmal Sorvall OTD-50B ultracentrifugában centrifugáljuk. A luoreszkáló alsó csíkot fecskendővel eltávolítjuk, íz etidium-bromidot háromszor izopropanollal extraháljuk. A kapott, plazmidot tartalmazó oldatot steril TE oldattal szemben dializáljuk, ami után megkapjuk a tiszta plJ41 plazmid DNS-t. A pIJ41 plazmid restrikciós és funkcionális térképét az 1. ábrán adjuk meg. 2. példa A pA CYC184 plazmid izolálása A. Az Escherichia colipACYC!84 lNCAIM B(P) 000261} tenyésztése Az E. coli pACYC184 [NCAIM B(P) 000261] törzset —20 °C hőmérsékleten tartjuk fent. TA táptalajon stacioner fázisig 37 °C hőmérsékleten tenyésztjük a sejteket, majd a tenyészet 2 ml-ét 1 ml 50%-os glicerin oldattal elegyítjük és —20 "C hőmérsékleten tároljuk. A TA táptalaj előállítására 10 g triptont (Bacto), 1 g élesztőkivonatot (Difco) és 5 g nátrium-kloridot 1 liter desztillált vízben feloldunk, az oldathoz 1 ml 0,1 mólos vizes magnézium-klorid és 1 ml 0,1 mólos vizes kalcium-klorid oldatot adunk. Az elegyet 20 percen át 121 ‘C hőmérsékleten sterilezzük. A sejtek tenyésztésére 100 ml TA táptalajt 500 ml térfogatú Erlenmeyer-Iombikban sterilezőnk. A steril táptalajt 0,1 ml, a fentiek szerint fagyasztva tárolt tenyészettel oltjuk be. A tenyésztést percenként 200-at forduló rázógépen végezzük 16 órán át, 37 °C hőmérsékleten. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
