197045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bifunkcionális rekombináns DNS klónozó vektor és a vektor transzformánsainak előállítására
13 197 045 D. A pACYC184plazmid izolálása A 2. példa A. pontjában megadottak szerint elő állított tenyészetet Sorvad RC5 centrifugában, 4 "C hőmérsékleten percenkénti 8000 fordulattal centrifugáljuk. A sejteket 10 ml TGE oldatban szuszpendáljuk. A TGE oldat előállítására 0,23 ml 40%-os vizes glükóz oldathoz hozzáadunk 0,25 m! I mólos vizes Trisz-HCl, pH 8,0 oldatot, 0,4 m! 0,25 mólos vizes EDTA oldatot és 9,12 ml ionmentes vizet. A TGE oldatban szuszpendált sejtekhez 20 ml NSE oldatot adunk. Az NSE oldat előállítása: 13,9 ml desztillált vízhez hozzáadunk 1,33 ml 3 mólos vizes nátrium-hidroxid, 0,8 ml 25%-os vizes nátrium-lauril-szulfát és 4 ml 0,25 mólos vizes EDTA oldatot. A tisztuló lízátumot 5 percen át 0 *C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 15 ml 3 mólos nátrium-acetátot (pH 4,8) adunk hozzá és 5 percen át 0°C hőmérsékleten állni hagyjuk. Az így kapott szuszpenziót 5 percen át, 0 °C hőmérsékleten, 10000 percenkénti fordulatszámú rotorban centrifugáljuk. A felüiűszót elkülönítjük és 0,54 térfogatrész —20 °C hőmérsékletű izopropanolt adunk hozzá, majd —20 °C hőmérsékleten hagyjuk állni 30 percen át. 0 °C hőmérsékleten centrifugálássai összegyűjtjük a kivált DNS-t (a rotor percenként 1000ü-et fordul). Az elkülönített csapadékot 10 ml 70%-cs etanolíal mossuk, majd exikátorban szárítjuk. A terméket 7 ml TE oldatban oldjuk. Az így izolált plazmid DNS-t az 1. példa B. pontjában megadottak szerint ejárva cézium-klortd és etidium-bromid jelenlétében ultracentrifugálással tisztítjuk, amikor megkapjuk a tiszta pACYC184 plazmid DNS-t. A plazmid restrikciós és funkcionális térképét a 2. ábrán adjuk meg. 3. példa A pGYOKll és pGYOKll rekombinánsplazmid előállítása Az 1. példa B. pontja szerint tisztított pIJ41 plazmid DNS oldat 10 ml-ét hozzáadjuk 10 pl MS pufferhoz. Az MS puffer előállítására 1000 pl 3 mólos vizes nátrium-klorid, 120 pl 1 mólos vizes Trisz-HCl (pH 7,5) és 120 pl 1 mólos vizes magnézium-klorid oldatot, továbbá 8,4 pl -merkaptoetanolt és 8650 pl desztillált vizet elegyítünk. A plazmid DNS-t tartalmazó reakciőelegyhez 3 egység Xhol restrikciós endonukleázt (BRL, Maryland, USA) adunk, majd 1 órán át 37 “C hőmérsékleten inkubáljuk. A 2. példa B. pontjához megadottak szerint előállított pACYC184 plazmid DNS oldat 10 pl-ét hozzáadjuk 10 pl MS pufferhoz, majd 3 egység Sáli restrikciós endonukleázzal (BRL, Maryland, USA) egészítjük ki a reakcióclegyet. Ezután 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A p!J41 plazmidot az Xhol restrikciós cndo--.ukleáz a G'TCGAG restrikciós helyen, Sail restri idős enzim a pACYCl84 plazmid DNS-t a ö'TCGAC szekvenciában hasítja. A hasítást követően a következő szekvenciák alakulnak ki °CAGCT ÍSalI) ésTCG/VOc (Xhol). l átható, hogy az így kialakult lineáris molekulák négy bázisból álló kinyúló végei (ragadós vég) komplementerek egymással. Mindkét reakcióelegyből 10—10 pl-t elegyítünk és az enzimek inaktiválására 10 percen át 68 °C hőmérsékleten tartjuk. Ezután 5 pl L elegye? adunk a lineáris DNS molekulákat tartalmazó oldathoz. Az L oldat előállítására 1,25 ml 1 mólos vizes Trisz-HCi (pH 8,0) és 0,25 ml 1 mólos vizes magnézium-klorid oldatot, 0,5 ml 1 mólos ditiotreitolt (BRL, Maryland, USA), 30,3 mg adenozún-trifoszíátot és 3 ml ionmentes vizes elegyítünk. A reakióelegyet a lineáris DNS molekulák összekapcsolására 1 egység T4 DNS ligázzal egészítjük ki (BRL, Maryland, USA), majd 16 órán át 14 *C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakcióelcgyben ekkor megjelenik a GYOKI1 és GYOKI2 rekombináns plazmid. A GYOKI1 és GYOK12 rekombindns plazrnidok előállításának sematikus rajzát a 4. ábrán adjuk meg, az 5. ábrán ismertetjük a két plazmid restrikciós és funkcionális térképét. :4 4. példa Az Escherichia coli pGYOKll és az Escherichia coli pGYOKll AGAIM B(P) 000265 előállítása A 3. példában megadottak szerint előállított, pGYOKll és pGYOKÍ2 rekombináns plazmidot tartalmazó reakcióelegy 5 pl-ével Escherichia coli JFL754 [NCA1M B(P) 000263] sejteket transzformálunk. Az E. coli JF1754 törzset a 2. példa A. pontja szerint tenyésztjük, azzal a különbséggel, hogy a TA táptalajt az E. coli pACYC184 helyett az E. coli JF1754 (MNG 263) [NCAIM B(P) 000263] törzzsel oltjuk. A milliliterenként 2Xl()8 sejtet tartalmazd tenyészetet 4 °C hőmérsékleten Sóival! RC5 centrifugában 5000 percenkénti lotor fordulatszámmal 5 percig centrifugáljuk és az üledéket 5 ml 0,01 mólos vizes nátrium-hidroxid oldatban szuszpendáljuk. A centrifngálást megismételjük, a sejteket 1,2 ml 0,02 mólos vizes Trisz-HCl pufferban (pH 6,0) szuszpendáljuk, 0,3 nil baktérium szuszpenzióhoz 5 pl, a 4. példában megadottak szerint előállított rekombináns plazmid DNS oldatot, majd 0,1 ml 0,15 mólos vizes kalcium-klorid és 0,13 mólos vizes magnézium-klorid oldatot adunk és az elegyet 10 percen át 0 °C, 2 percen át 42 °C, majd 60 percen át 0 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 5 ml TA táptalajjal egészítjük ki a szuszpenziót, majd 30 percren át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk. Ezt követően a fentiek szerint centrifugálva elkülönítjük a sejteket. Az izolált transzformált sejteket 30 pg/ml kioramfenikolt tartalmazó szilárd halmazállapotú TAA táptalajra szélesztjük. A TAA táptalaj a TA táptalajjal azonos összetételű, de 2,2% agait (Ihlető) tartalmaz. A tenyészeteket 24 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A CmR telepeket elkülönítjük (transzformációs frekvencia:' 6000 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
