197045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bifunkcionális rekombináns DNS klónozó vektor és a vektor transzformánsainak előállítására
197 045 )ü határozó gént tartalmazó DNS fragmenst DNS ligázzal a hasítási helyre beépítjük. A találmány szerinti plazmidokkal bármely restrikciómentes Escherichia coli és Streptomyces törzset transzformálhatunk, hiszen a plazmidok tartalmazzák az E. coli és Streptomyces sejtekben replikációjukat biztosító replikációs origót. Ilyen Streptomyces lehet például, de nem korlátozó jelleggel, a Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces kanamyceticus, Streptomyces tenebrarius, Streptomyces parvulus, Streptomyces albus, Streptomyces fradiae, Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces anlibioticus, Streptoinyccs erythreus, Streptomyces lipmanii, Streptomyces clavuligerus, Streptomyces lactamdurans, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces cattleya, Streptomyces flavus stb. A találmány szerinti rekombináns bifunkcionális DNS vektorokból ismert módszerekkel kihasítjuk az egyes antibiotikumokra rezisztenciát biztosító géneket és ezeket más DNS szakaszokba beépíthetjük. Ezek érthetően szintén a találmány oltalmi köréhez tartoznak. A szakember számára érthetően a találmány oltalmi köréhez tartoznak a pGYOK12 és pGYOK.125 beépülést izomerjei is. A plJ41 plazmid más restrikciós helyére is beépíthető a pACYC184 lineáris fragmense, ilyen hely például az EcoRI, HindlII, Clal, BstEII, BglII, BamHI stb. hely. A beépülési izomereken kívül a találmány oltalmi köréhez tartozik a pGYOK!2 és pGYOK125 ellenkező orientációjú alakja is. A pGYQKI2 ellenkező orientációjú páiját pGYOKU-nek neveztük el, ebben a pACYCÍ 84-ből származó DNS szakasz ellenkező irányban épült be. A találmány szerinti rekombináns DNS klónozó vektorok előnye, hogy mind Escherichia coliban, mind Streptomyces sejtekben replikálódnak, az eddig vagy a jövőben beépített információk kifejezhetők mindkét genus fajaiban. Az Escherichia coliban könnyen elvégezhetők az átklónozási, hibridizációs és mutagenezises kísérletek, ezekből nagy mennyiségű rekombináns plazmid DNS izolálható. A találmány szerinti rekombináns DNS kiónozó vektor DNS-ekbe nem szelektálható DNS szegmensek építhetők be. Ha például a pGYOKI2 plazmid NeoR génjébe Kpnl restrikciós enzim és DNS ligáz segítségével egy antibiotikum bioszintézisben résztvevő gént építünk be, majd a kapott rekombináns plazmiddal Streptomyces lividanst vagy E. colit transzformálunk, a transzformánsok közül kiválasztjuk a Neos (neomicinre érzékeny) és 'lliio1' CmR (thiosztrepton és kloramfenikol rezisztens) egyedeket, olyan kiónhoz jutunk, amely antibiotikum bioszintézisben résztvevő gént tartalmaz. A gént a hibrid plazmiddal antibiotikum termelő sejtbe juttatva antibiotikum bioszinlézist befolyásolhatunk. A találmány szerinti rekombináns DNS klónozó vektor DNS-ekbe beépíthetünk példányszámot (copy number) növelő vagy szabályozó elemeket is. Ilyen lehet például, de nem limitáló jelleggel, egy promoter, represszor, inducer, attenuator stb. A találmány szerinti rekombináns, bifunkcionális DNS klónozó vektorokba beépíthetünk Streptcmyces sejtekkel a mai napig előállított termékek, például antibiotikumok bioszintézisét meghatározó vagy befolyásoló géneket, ilyen antibiotikumok például, de nem limitáló jelleggel, az aminoglükozidok, például a sztreptomicin, neonticin, tobramicin, apramicin, kanamicin, a makrolidok, például az erithromicin, oleandomicin, tilozin, a poliéterek, például a monensin és nigeriéin, a ß-laktämok, például a cefamicin C, a poliének, például a candicidin és nisztatin stb. Beépíthetünk azonban fontos fehérjék, például inzulin, proinzulin, interferon, növekedési hormon stb. bioszintézisét meghatározó genetikai információkat is. Ez azért fontos, mert a Streptomyces törzsek fermentációs technológiái ellentétben az E. coliéval jól kidolgozottak, ezenkívül a Streptomyces sejtek nem termelnek colicinhez hasonló, a termékből nehezen eltávolítható fehérjéket. A találmány szerinti eljárással előállított pGYOKI25 plazmid Tn5 transzpozont tartalmaz. A pGYOKI25 rekombináns plazmiddal transzformált sejtekben a Tn5 mozgása révén génátrendeződéseket indukál, azaz mutációkat okozhat. A találmány szerinti bifunkcionális, rekombináns DNS vektorok tehát alkalmasak mutáns sejtek előállítására. A mutációk kedvezően befolyásolhatják cgy-egy ipari szempontból fontos termék bioszintézisét. A találmány szerinti eljárást a továbbiakban példákkal részletesen ismertetjük. A példák csak szemléltető jellegűek, a találmány oltalmi körét nem szűkítik. 7. példa A pIJ41 plazmid izolálása A. A Streptomyces lividans pIJ41 [NCA1M B(P) 000258] tenyésztése A Streptomyces lividans pIJ41 [NCAíM B(P) 000258] mikroorganizmust R2Y'E jelű, agart tartalmazó táptalajon tartjuk fent. A táptalaj összetétele a következő: Szacharóz 103,00 g Kálium-szulfát 0,25 g Magnézium-klorid-hexahidrát 10,12 g Glükóz 10,00 g Kazaminsav (Oxoid)+ 0,10 g Agár (Bacto)1 + 22,00 g Desztillált víz 800,00 ml (végtérfogat)-+Oxoid United, London, Anglia 1 'Difco Laboratories, Detroit, USA. A fenti táptalajt 30 percen át 121 °C hőmérsékleten sterilezzük, majd hozzáadjuk az alábbi előre sterilezett oldatokat: Kálium-dihídrogén-foszfát, 0,5%-os oldat 2,0 ml 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
