197045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bifunkcionális rekombináns DNS klónozó vektor és a vektor transzformánsainak előállítására
o la/ u<+u klónozó vektorok és a vektorok transzíormánsainak előállítására ágy járunk el, hogy a) Streptomyces lividans eredetű funkcionális replikációs origót és antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket tartalmazó DNS szakaszt és b) Escherichia coliban funkcionális replikációs origót és antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket tartalmazó DNS szakaszt és adott esetben c) antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket hordozó transzpozon DNS-t összekapcsolunk, majd az így kapott rekombináns DNS klónozó vektorral Streptomyces vagy Escherichia coli sejteket transzformálunk és a transzformánsokat szelektáljuk és/vagy izoláljuk a mutánsokat. A Streptomyces lividans eredetű funkcionális replikációs origót tartalmazó DNS fragmenst a Streptomyces lividans pIJ41 törzsből (Thompson, Kieser, Ward és Hopwood, Gene, 20, 51, 1982) izoláljuk. A pIJ41 plazmid restrikciós térképét és antibiotikum rezisztenciát meghatározó génjeinek helyét (NeoR, ThioR) a mellékelt 1. ábrán adjuk meg (Thompson és munkatársai, 1. előbb). Ez, és a további ábrák sem méretarányosak. A jelölt restrikciós helyekre vonatkozóan lásd Roberts közleményét (mint előbb). Az Escherichia coliban való fentmaradást biztosító replikációs origót tartalmazó DNS fragmenst az Escherichia coli pACYC184 törzsből (Chang és Cohen, J. Bacteriol., 134, 1141, 1978) izoláljuk. A plazmid kloramfenikollal (Cm8) és tetraciklinnel (Te”) szembeni rezisztenciát határoz meg, restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 2. ábrán adjuk meg (Chang és Cohen, 1. előbb). A találmány szerinti eljárás során transzpozonként a Tn5 jelű, kanamicinnel (KmR) és sztreptomicinnel (SmR) szembeni rezisztenciát meghatározó transzpozont használjuk. A Tn5 DNS forrása lehet bármely Tn5-öt hordozó mikroorganizmus, a jelen leírásban megadott kísérletekben az Escherichia coli UNF510 jelű törzset használjuk (Merrick és munkatársai, Molec. Gen. Genetics, 65, 103, 1978). A Tn5 transzpozon restrikciós és funkcionális térképét a 3. ábrán adjuk meg [Putnoky és munkatársai, Molec. Gen. Genetics, 191, 288—294 (1983)]. A PKm a KmR gén promoterét jelenti. A plJ41 plazmid izolálására a Streptomyces lividans pIJ41 törzset szerves szén- és nitrogénforrást tartalmazó táptalajon 28 "C hőmérsékleten tenyésztjük, majd ismert módon (Kieser és munkatársai, Molec. Gen. Genetics, 185, 223, 1982) izoláljuk a plazmid DNS-t. A pACYC184 plazmid izolálására az Escherichia coli pACYC184 törzset szerves szén- és nitrogénforrást tartalmazó táptalajon 37 °C hőmérsékleten tenyésztjük, majd ismert módon (Bimbóim és Doly, Nucl. Acids Res., 7, 1513, 1979) izoláljuk a pACYC184 plazmidot. Bifunkcionális rekombináns klónozó DNS vektor előállítására a pIJ41 plazmidot Xhol restrikciós enzimmel (BRL, Maryland, USA), míg a pACYC184 plazmidot Sáli enzimmel (BRL, Maryland, USA) hasítjuk. A pACYC184 DNS a tetraciklin rezisztenciát meghatározó génen (TcR) belül hasad. A két lineáris DNS molekulát T4 DNS Lgázzal (BRL, Maryland, USA) összekapcsoljuk, najd a ligációs eleggyel Escherichia coli JF1754 (r~m+ metB hisB leuB) sejteket transzformálunk Ismert módon (Bergmans és munkatársai, J. Bacteriol. 146,564, 1981). A transzformánsokat szerves szén- és nitrogénforrást és kloramfenikolt tartalmazó agaron szélesztjük. A táptalajon kizárólag azok a sejtek növekednek teleppé, amelyek tartalmazzák a CmR fenotípust biztosító gént. Ezek közül tetraciklint tartalmazó táptalajon végzett replikációval kiválasztjuk azokat, amelyek tetraciklinre érzékenyek. Mivel a pIJ41 plazmid restrikciós fragmensét a pACYC184 Te11 génjébe építettük be, a Cm" és Tcs (tetraciklinre érzékeny) sejtek tartalmazzák a pGYOKI jellel jelölt rekombináns plazmidokat. A folyamatot a 4. ábrán szemléltetjük. Néhány E. coli transzformánst szerves szén- és nitrogénforrást tartalmazd táptalajon 37 °C hőmérsékleten 20 órán át tenyésztettünk, majd ismert módon (Bimbóim és Doly, Nucl. Acids Res. 7, 513, 1979) izoláltuk a rekombináns plazmidokat. A restrikciós enzimekkel való emésztést követően í.garóz gélen végzett gélelektroforetikus analízis adatai szerint a pGYOKI rekombináns plazmid két orientációban tartalmazza a két restrikciós fragmenst (lásd 6a. ábrát). A két orientációjü plazmidot a pGYOKJl-nek és pGYOKI2-»ek neveztük el. A két rekombináns plazmid funkcionális és restrikciós térképét az 5. ábrán adjuk meg. A 6. ábrán megadjuk a plJ41, a pACYC184, a pGYOKIl, a pGYOK12 és a pGYOKI25 restrikciós analízishez felhasznált gélelektroforetikus képét. A 6a. ábrán az alábbi fragmenseket látjuk: 1. lambda DNS, Hindii! 2. pGYOKIl, HindllI 3. pGYOKI2, HindllI 4. pGYOKIl, BandII 5. pGYOK12, Bandii 6. pGYOKIl, EcoRI 7. pGYOKI2, EcoRI 8. pGYOKIl, KpnI 9. pGYOKI2, KpnI. A 6b. ábrán az alábbi restrikciós fragmenseket látjuk: 1. pACYC184, Sáli 2. pIJ41, Xhol 3. pGYOKI25, KpnI 4. pGYOKI25, EcoRI 5. pGYOKI25, BamHI 6. pGYOKI25, HindllI 7. lambda DNS, HindllI. A pGYOKI2 jelzésű rekombináns plazmidba ezután bejuttatjuk a Tn5 (Km8 SmR) transzpozont. Ennek során ügy járunk el, hogy a pGYOK12 plazmidot E. coli UNF510 (Merrick és munkatársai, Molec. Gen. Genet. 165, 103, 1978) sejtekbe transzformáljuk, az E. coli sejtek a kromoszómában Tn5 transzpozont hordoznak. A transzformált sejteket ügy mutatjuk ki a tenyészet többi sejtjei közül, hogy kloramfenikolt tartalmazó táptalajon 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
