197045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bifunkcionális rekombináns DNS klónozó vektor és a vektor transzformánsainak előállítására
5 197 045 6 szelektálunk. Az itt kinövő sejtek tartalmazzák a CmR gént hordozó pGYOKI2 plazmidot. A transzformánsokat ezután tenyésztjük, a tenyésztés szerves szén- és nitrogénforrást tartalmazó táptalajon történik, 37 °C hőmérsékleten. A sejtek növekedése közben a Tn5 transzpozon bizonyos gyakorisággal „átugrik” a pGYOKI2 plazmidra. Ezután izoláljuk a plazmidot (Bimbóim és Doly, Nucl. Acids Res. 7, 1513. 1979) és kanamicinre szenzitív E. coli JF1754 sejtekbe juttatjuk (Bergmans és munkatársai, J. Bacteriol. 146, 564, 1981). A transzformánsokat kanamicin és kloramfenikol rezisztenciára szelektáljuk. A szelekcióval azokat a transzformánsokat választjuk ki, amelyek a kanamicin rezisztenciát meghatározó Tn5-öt hordozó pGYOKI2 plazmiddal rendelkeznek. A folyamatot a 7. ábrán ismertetjük. Egy kettős rezisztens transzformánst kiválasztottunk és a benne lévő Tn5 transzpozont tartalmazd rekombináns plazmidot pGYOKI25-nek neveztük el (restrikciós és funkcionális térképét a 12. ábrán adjuk meg). A Streptomyces sejtek transzformálására izoláljuk a rekombináns plazmidokat. A pGYOKI2 és pGYOK125 jelű rekombináns DNS klónozó vektorokat tartalmazó E. coli törzseket szerves szén- és nitrogénforrást tartalmazó táptalajon tenyésztjük, majd a 2Xlü8/ml sejtet tartalmazó tenyészetből ismert módon (Bimbóim és Doly, Nucl., Acids. Res. 7, 1513, 1979) izoláljuk a plazmidokat. A tisztítást CsCl gradiens centrifugálással végezzük Sorall, OTD-50B ultracentrifugával, T865.1 rotorban, 15 °C-on 48 órán át 39 000 ford/perccel. A tisztított pGYOKI2 és pGYOKI25 DSN-sel Streptomyces lividans 66 és Streptomyces tenebrarius MNG 204 sejteket transzformálunk. A Streptomyces sejteket szerves szén- és nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon süllyesztett, levegőztetett körülmények között 28 °C (Str. lividans 66), illetve 37 ”C (Str. tenebrarius MNG 204) hőmérsékleten tenyésztjük, majd 48 óra múlva hasonló összetételű, de glicint tartalmazó táptalajra oltjuk. A tenyésztést és átoltásokat növekvő mennyiségű glicint tartalmazó táptalajokra addig folytatjuk, mfg a Streptomyces lividans 66 1%, a Streptomyces tenebrarius 4% glicin koncentráció mellett is növekszik.. Ekkor a sejteket összegyűjtjük és 1 mg/ml lizoztmot (Serva) tartalmazó izoozmotikus oldatban szuszpendáljuk protoplasztok előállítására. A kapott protoplaszt-szuszpenzióhoz hozzáadjuk az előzőleg izolált pGYOK12 és pGYOKI25 DNS-t, majd izoozmotikus, agart tartalmazó táptalajra szélesztjük a transzformációs elegyet. A tenyészeteket 6 napon át inkubáljuk. A regenerálódó protoplasztokból kifejlődött sejteket lemossuk a táptalaj felületéről és a kapott sejtszusz - penziót neomicint, kloramfenikolt és/vagy kananűcint tartalmazó szilárd halmazállapotú táptalajra szélesztjük. A tenyészeteket 6 napon át inkubáljuk, majd az antibiotikumok jelenlétében növekvő, rezisztens telepeket izoláljuk. Ezek a sejtek tartalmazzák a NeoR CmR és Km* fenotípust meghatározó pGYOK12, illetve pGYOK125 rekombináns plazmidot. Az izolált telepeket megvizsgáljuk Itz1 karakterre. Az ltz+ törzsekben lévő konjugatív plazmidok úgynevezett „lethal zygosis”-t okoznak (Bibb, Ward és Hopwood, Nature, 274, 398, 1978). Ez azt jelenti, hogy a plazmidot tartalmazó sejtekből átkerül a plazmid DNS a környezetükben lévő plazmidmentcs sejtekbe, és ez a folyamat ismeretlen mechanizmussal gátolja azok növekedését és/ vagy spórázását. így a spórázó itz- sej te között sötét színű, nem spórázó sejtekből álló úgynevezett „pock’’-ok figyelhetők meg. Megfigyeltük, hogy a pGYOK!2 és pGYOK125 lethal zygosist okoz (8. ábra). Az Itz tulajdonság felhasználható a plazmidokat tartalmazó sejtek szelektálására. Néhány NmR CmR és KmR pGYOKI2, illetve pGYOKI25 rekombináns plazmidot tartalmazó tenyészetből izoláljuk a plazmid DNS-t és agaróz gélen elektroforetikus analízist végzünk. Ugyanakkor E. coli Jl’1754 sejteket transzformálunk. A pGYOK12-vel transzformált E. coli sejtek kloramfeníkolra rezisztensek és tartalmazzák a plazmidot. A 9. ábrán megadjuk az ELFO-analízis eredményeit. A 9. ábra íragmensei: 1. lambda DNS, Hindlll 2. pGYOKI2, BamHI 3. pGYOK12, EcoRI 4. Str. lividans pGYOKI2, emésztetlen plazmid 5. Str. lividans pGYOKI25, emésztetlen plazmid. A 2. és 3. csíkon látható plazmid-fragmenseket úgy kaptuk, hogy Str. lividans pGYOKI2-ből izoláltuk a plazmidot, majd E. coliba transzformáltuk és az innen izolált DNS-t emésztettük BamHI, illetve EcoRI restrikciós endonukleázzal. A találmány szerinti eljárással előállított bifunkcionális rekombináns DNS klónozó vektorok egyike Tn5 transzpozont tartalmaz. Ismeretes, hogy az IS elemek és a transzpozonok (úgynevezett ugráló gének) a kromoszóma különböző helyeire beépülhetnek, onnan kihasadhatnak és más DNS szakaszba épülhetnek be. Mozgásuk közben géninaktiválást, deléciót, kromoszóma átrendeződést váltanak ki (Calos és Miller, Cell 20, 579, 1980). Mivel a biológiai aktív vegyületeket termelő mikroorganizmusok mutánsai ipari szempontból értékesek lehetnek, megvizsgáltuk, hogy a pGYOKI25 rekombináns plazmidba beépített Tn5 transzpozon valóban létrehoz-e mutációkat a Streptomyces sejtekben? A pGYOK125 rekombináns plazmiddal transzformáit Streptomyces lividans 66 sejteket szervetlen sókat, glükózt és kazaminsavat (Casein Hydrolysate, Oxoid, Anglia) tartalmazó táptalajon tenyésztjük 28 °C hőmérsékleten, 24 órán át. Ezután a tenyészetet centrifugáljuk, a sejteket mossuk, majd minima! táptalajt és kazaminsavat tartalmazó minimal táptalajt oltunk és 28 °C hőmérsékleten tenyésztünk. 6 óra múlva 500 pg/ml penicil‘lint adunk a minimal táptalajhoz, és folytatjuk a tenyésztést. A penicillin a minimal táptalajban növekvő sejteket elpusztítja. 24 órás tenyésztés után kazaminsavat tartalmazó sziláid halmazállapotú minimal táptalajra szélesztjük mindkét tenyészetet, majd 28 °C hőmérsékleten inkubálunk 4 na-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
