197044. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces és E.coli sejtekben használható kimer klónozó vektorok előállítására
13 197 044 14 gyületeket határoznak meg, vagy olyan enzimeket, amelyek meghatározzák vagy fokozzák antibiotikumok vagy más termékek bioszintézisét. Azzal, hogy a találmány szerinti eljárással lehetségessé válik a fenti dezoxi-ribonukleinsav-szegmensek beépítése, stabilizálása és bejuttatása Streptomyces és E. coli sejtekbe, lehetségessé válik Streptomyces sejtek által termelt antibiotikumok termelésének fokozása rckombináns genetikai manipulációval. Ezenkívül, mivel az SCP2 vagy az SCP21 plazmid replikácids origója kisszámú másolatot határoz meg, gyakorlatilag bármilyen dezoxiribonukleinsav-szekvencia, még az is, amely nagyszámú másolatot meghatározd plazmidon kifejezve letális, könnyen klónozható a találmány szerinti vektorokba, s bejuttatható Streptomyces és E. coli sejtekbe. Az SCP2 és az SCP2* plazmidok forrása sorrendben a Streptomyces coelicolor A3 (2) és a Streptomyces coelicolor M110. Ezek a törzsek különböző táptalajokon tenyészthetők. A táptalajba szénforrásként például melaszt, glükózt, dextrinl és glicerint, nitrogénforrásként például szójalisztet, aminosavak keverékét vagy peptont adagolunk. A táptalajba szervetlen sókat is adunk, ezek például nátrium-, kálium-, ammonium-, kalcium-, foszfát-, klorid- vagy szulfátionokra, vagy más ionokra diszszociáló sók. Mint ahogy más mikroorganizmusok növekedéséhez és fejlődéséhez is szükséges, a táptalajhoz nyomelemeket is adagolunk. A nyomelemek a táptalaj egyéb összetevőiben általában szennyeződésként már jelen vannak. A Streptomyces coelicolor Ml 10 és S. coelicolor A3 (2) törzset levegőztetett fermentációs körülmények közötr tenyésztjük 5 és 9 közötti pll-érlékcn, 15 "C és 40 °C közötti hőmérsékleten. Az SCP2 és SCP2* plazmid nagyszámú másolatát tartalmazó sejtek előállítására azonban a tenyésztést 7,2 pK-n kezdjük, és a tenyészet hőmérsékletét 30 °C-on tartjuk. Ha a Streptomyces coelicolor M110 és S. coelicolor A3 (2) törzset a fenti körülmények között tenyésztjük, úgy olyan tenyészetet kapunk, amelyből az SCP2* és az SCP2 plazmidok ismert módszerekkel könnyen izolálhatok. Az alábbiakban a találmány szerinti eljárást példákkal szemléltetjük I. példa Az SCP2X plazmid izolálása A) A Streptomyces coelicolor Ml 10 tenyésztése A Streptomyces coelicolor__ Ml 10 (NRRL 15041) törzs vegetatív inokulumának előállítására a törzset süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között tenyésztjük 50 ml, 35 g/1 Trypticase szóját tartalmazó, ionmentes vízzel készült táptalajban. A Trypticase szóját a Difco Laboratories-től (Detroit, Michigan, USA) vásároltuk. A Trypticase. szójás inokulumot 48 órán át inkubáljuk 30'C hőmérsékleten. Ezután homogenizáljuk az 50 ml térfogatú tenyészetet, majd 450 ml steril YEMES'j táptalajhoz öntjük. Ennek a táptalajnak az összetétele a következő: 0,3% élesztőkivonat 0,5% pepton 0,3% malátakivonat 1,0% dextróz 34,0% szacharóz 0,1% magnézium-klorid 0,1% glicin. A tenyészetet 40, de legfeljebb 65 órán át inkubáljuk 30 *C hőmérsékleten. A tenyészet pH-ját nem állítjuk. Az inkubációt követően a Streptomyces coelicolor Ml 10 sejtekből összegyűjtésüket követően izoláljuk u plazmid dczoxi-ribonukleinsavat. B) Plazmid izolálás 10 g centrifuganedves Streptomyces coelicolor Ml 10 sejtet izolálunk centrifugálással. A centrifugálást 10 percen át 4 “C hőmérsékleten végezzük, percenként 10.00ü-ct forduló rotorban. Ezután 1 g nedves sejtre számolva 10 ml TES-puffert adagolunk. A TES-puffer összetétele a következő: 0,01 mól trisz.-(hidroxi-metil)-amino-etán (trisz) 0,001 mól etilén-diarnin-tetraecetsav 25 % szacharóz, pH=8. A sejteket vortexezzük, majd 1 g centrifuganedves sejtre számolva 10 ml 0,25 mólos etilén-diamin-tetraeceísavat (pH=8) adagolunk, majd 1 g centrifuganedves sejtre számolva 5 ml TES-pufferral készült lizozim-oldatot. Az oldat ml-enként 10 mg üzozimot tartalmaz. 15 percen át 37 *C hőmérsékelten inkubáljuk a szuszpenziót, majd 1 g centrifuganedves sejtre számolva 1,5 ml 20%-os nátrium-iauril-szulfátot (BDH Chemicals Ltd., Poole, Anglia) adagolunk. A kapott elegyet 30 percen át szobahőmérsékleten hagyjuk állni, majd annyi 5 mólos nátriuiu-klorid-oldatot adagolunk, hogy a nátrium-klorid végkoncentrációja 1 inól/1 legyen. 15 percen át szobahőmérsékleten hagyjuk állni az elegyet, majd 2 órán át jégfiirdőbeu tároljuk. A 11- zátumot 20 percen át, 4 °C hőmérsékleten, percenként 17.500-at forduló rotorban centrifugáljuk, a felülúszdt összegyűjtjük és 0,64 térfogat izopropilalkoholial keverjük. A dezoxi-ribonukleinsav csapadékot centrifugálással gyűjtjük össze. A centrifugálásl 15 percen át 4“C hőmérsékleten végezzük, percenként 10.000-et forduló rotorban. Levegőn szárítjuk a csapadékot, majd 1 g nedves sejtre számolva 1 ml TE-pufferban szuszpendáijuk. A TE- puffer összetétele a következő: 0,01 mól trisz és 0,001 mól etilén-diarnin-tetraecetsav (literenként) Ezután 20 órán át 20 “C hőmérsékleten, percenként 50.000-et forduló rotorban cézium-klorid gradiensen, propidium-jodid jelenlétében centrifugálunk a plazmid dezoxi-ribonukleinsav tisztítása céljából. A centrifugálást követően az SCP2* dezoxiribonukleinsav csíkot eltávolítjuk, és a propidiumjodidot ismert módon extraháljuk. A cézium-klo-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
