197044. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces és E.coli sejtekben használható kimer klónozó vektorok előállítására
15 197 044 16 ríd-dezoxi-ribonukleinsav-oldatot —20 °C hőmérsékleten tároljuk. Használat előtt a dezoxi-ribonukleinsavat PD10 (Bio Rád.) oszlopon TE-oldat jelenlétében kisózzuk, vagy TE-oldattal szemben dializáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk, és TE-oldatban újra oldjuk. 2. példa A pLRl plazmid előállítása A) A pIJ2plazmid emésztése HindlII enzimmel 20 pl (20 pg) pIJ2 dezoxi-ribonukleinsavat [Thompson és munkatársai, Nature, 286, 525 (1980)] 5 pl marha szérum albumint (1 mg/ml-es oldat), 19 pl vizet, 1 pl, 3 New England Bio Labs. egységet tartalmazó HindlII restrikciós enzimet és 5 pl összetételi! reakcióelegyet keverünk, és inkubálunk 2 órán át, 37 °C hőmérsékleten. A fentiekben használt HindlII reakcióelegy az alábbi összetételű: 600 mmól nátrium-klo rid 100 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,9 70 mmól magnéz tu m-klorid 10 mmól ditio-treitol (literenként) A restikciós és a többi enzimet is az alábbi cégektől szereztük be: New England Bio Labs., Inc. 32 TozerRoad Beverly, Massachussetts 01915 Boehringer-Mannheim Biochemicals 7941 Castleway Drive Indianapolis, Indiana 46250 Bethesda Research Laboratories (BRL) Box 6010 Rockville, Maryland 20850 Research Products Miles Laboratories, Inc. Elkhart, Indiana 46515. Az inkubáció után a reakciót 50 pl 4 mólos ammónium-acetát és 200 pl 95%-os etanol adagolásával állítjuk le. A kivált dezoxi-ribonukleinsav csapadékot kétszer 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomású térben szántjuk, 20 pl TE- pufferban szuszpendáljuk és —20 °C hőmérsékleten fagyasztva tároljuk. B) A pBR322 plazmid emésztése HindlII enzimmel 8 pl (4 pg) pBR322 plazmid dczoxi-ribonukleinsavat, 5 pl reakcióelegyet, 5 pl, 1 mg/ml koncentrációjú marha szérum albumin oldatot, 31 pl vizet és 1 pl HindlII restrikciós enzimet elegyítünk, és az elegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakció leállítását úgy végezzük, hogy az elegyet 10 percen át 60 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 50 pl ammónium-acetátot és 200 pl 95%-os etanolt adagolunk. A kivált dezoxi-ribonukleinsav csapadékot kétszer 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk és í 5 pl vízben szuszpendáljuk. C) A HindlII enzimmel emésztett pIJ2 és pBR322 plazmid összekapcsolása A 2A) példában megadottak szerint előállított ) lindlll enzimmel kezelt pIJ2 plazmid 20 pl-ét és a 2B) példában megadottak szerint előállított Hindl- H enzimmel kezelt pBR322 plazmid 20 pl-ét elegyítjük, az elegyhez 5 pl, 1 mg/ml koncentrációjú marha szérum albumin oldatot, 1 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt és 5 pl ligációs elegyet adunk. A T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt az előbbi cégtől vásároltuk: New England Bio Labs., Inc. 32 Tozer Rd. Beverly, Massachussetts 01915. A ligációs elegy összetétele a következő: 500 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,8 200 mmól ditio-treitol 100 mmól magnézium-klorid 10 mmól adenozin-trifoszfát (literenként) Az elegyet 4 órán át 16 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakció leállítására 50 pl, 4 mólos ammónium-acetátot és 200 pl, 95%-os etanolt adagolunk. A kapott dezoxi-ribonukleinsav csapadékot kétszer 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, és ezután TE-pufferban szuszpendáljuk. A szuszpendált dezoxi-ribonukleinsav tartalmazza a pLRl plazmidot. 3. példa Az E. coli K12 HBlOl/pLRl előállítása 10 ml E. coli K12 HB101 sejtet [Bolivar és munkatársai, Gene, 2, 75—93 (1977)] centrifugálással összegyűjtünk, és ezután 10 ml 0,01 mólos nátrium-klorid-oldatban szuszpendálunk. Ezután újra ülepítjük a sejteket, 10 ml, 0,03 mólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, és 20 percen át jégfürdőben inkubáljuk. Harmadszor is ülepítjük a sejteket, majd 1,25 ml, 0,03 mólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk. A kapott sejtszuszpenzió alkalmas transzformációra. A 2C) példában megadottak szerint előállított és TE-pufferban lévő pLRl plazmidot etanollal kicsapjuk, 150 pl, 30 mmólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, és enyhén kevergetve 200 pl kompetens E. coli K12 HB101 sejtszuszpenzióval elegyítjük. A kapott szuszpenziót 45 percen át jégfürdőben inkubáljuk, majd 1 percen át 42 °C hőmérsékleten. Ezután 3 ml L-táptalajt [Bertani, J. Bacteriology, 62, 293 (1951)] táptalajt adagolunk, amely 50 pg/rní ampicillint tartalmaz. 1 órán át 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
