197044. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces és E.coli sejtekben használható kimer klónozó vektorok előállítására
11 197 044 12 plazmidok előállítása céljából, fizikai analízisre és restrikciós helyek térképezésére E. coli sejtekbe, majd ezután funkcionális analízisre és törzsjavításra visszajuttathatók Streptomyces sejtekbe. Ez különösen előnyös, mivel a plazmidok sokszorosítása és a plazmidokkal való manipuláció gyorsabban és kényelmesebben elvégezhető E. coli-ban, mint Streptomyces sejtekben. így például a találmány szerinti vektorokat sokszorosíthatjuk E. coli KI2 sejtekben oly módon, hogy spektinomicin vagy kloramfenikol jelenlétében növesztjük a törzset. Ezenfelül, mivel az összes plazmid vektor E. coli K12 sejtekben kifejeződő rezisztencia markért tartalmaz, a rekombinánsok könnyen szelektálhatók. így könnyen izolálhatunk nagy mennyiségű plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, és mindezt rövidebb idő alatt érjük el, mintha ugyanezt Streptomyces sejtekből kívánnánk előállítani. Miután az adott rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kísérleteket elvégeztük az E. coli gazdarendszerben, izolálhatjuk az adott Streptomyces dezoxi-ribonukleinsavat, plazmid alaká alakíthatjuk, és ezután Streptomyces gazdasejtekbe transzformálhatjuk. Mivel a találmány szerinti vektorokat Streptomyces sejtekben szelektálhatjuk, a rekombináns kiónok azonosítása gyorsan elvégezhető. A találmány szerinti rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és transzformánsok széleskörűen használhatók, és így kielégítik az igényt a Streptomyces és E. coli sejtekben egyaránt felhasználható klónozó hordozók iránt. Ezenfelül a találmány szerinti vektorok pock fenotfpust kifejező képessége és antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó jellegük funkcionális eszközt biztosít a transzformánsok szelektálására. Ez azért fontos, mivel a vektor dezoxi-ribonukleinsavat felvett egyes sejtek meghatározása és szelektálása gyakorlati jelentőséggel bír. A találmány szerinti vektorokba beépíthetünk más, olyan dezoxi-ribonukleinsav-szegmenseket is, amelyeknek jelenléte kísérleti úton nem kimutatható, majd a nem szelektálható dezoxi-ribonukleinsavat hordozó transzformánsokat megfelelő antibiotikummal vagy más fenotípuson alapuló szelektálással izolálhatjuk. Az ilyen, nem szelektálható dezoxí-ribonukleinsavszegmenseket bármely helyre beépíthetjük, kivéve azokat, amelyek szükségesek a plazmid funkcionálásához és replikácíójához. Ilyen gének lehetnek az antibiotikumokat módosító enzimeket leíró gének, vagy bármilyen típusú szabályozó gének. Részletesebben, egy gént hordozó, nem szelektálható dezoxi-ribonukleinsav-szegmens beépíthető egy plazmidba, például a pJL192 plazmádba a 7,7 kb nagyságú EcoRl-HindlH rezisztenciát meghatározó fragmens belső BamHI restrikciós helyére. Ez a beépítés inaktiválja a neonácin rezisztencia gént, és így könnyen azonosíthatjuk azokat a Streptomyces transzformánsokat, amelyek tartalmazzák a rekombináns plazmidot. Úgy járunk el, hogy először M pock morfológiára szelektálunk, és ezután azonosítjuk azokat az M transzformánsokat, amelyek neomicinre nem érzékenyek. Hasonló módon, ha egy dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst beépítünk a pJL180 szemléltető jellegű plazmid egyetlen Psti restrikciós helyére, úgy inaktiváljuk az ampicillin rezisztencia gént. így azok az E. coli transzforrnánsak, amelyek hordozzák a rekombináns plazmidot, könnyen azonosíthatók oly módon, hogy először kloramfenikol rezisztenciára, majd ezt követően a kloramfenikol rezisztens transzformánsok között ampicillin érzékenységre szelektálunk. így azzal, hogy Streptomyces és E. coli sejtekben antibiotikum rezisztenciára vagy más, fenotfpusos markerre szelektálhatunk, lehetővé válik azon igen ritka sejtek hatékony izolálása, amelyek hordoznak egy a Jött, számunkra érdekes, nem szelektálható dezox;-ribonukleinsavat. Az előzőekben ismertetett antibiotikum rezisztencián alapuló, funkcionális kísérletek felhasználhatók egyes antibiotikum rezisztencia gének kifejeződését szabályozó kontroll elemeket hordozó dejoxi-ribonukleinsav-szegmensek azonosítására is. Ilyen szegmensek lehetnek például a promoterek, rttenuátorok, represszorok, inducerek, riboszómá!is kötőhelyek és mások. Ezeket felhasználhatjuk .Streptomyces és E. coli sejtekben lévő más gének 'kifejeződésének szabályozására. A találmány szerinti eljárással előállított, antibiotikum rezisztenciát meghatározó vektorok felhasználhatók annak bizonyossá tételére is, hogy a beépített dezoxi-ribonukleinsav-szegmensek stabilan megmaradnak a gazdasejtekben több generáción át. A géneket vagy a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket, amelyeket antibiotikum rezisztenciát meghatározó fragmenshez kapcsoltunk, és melyeket Streptomyces vagy E. coli sejtekben szaporítunk, úgy tartunk fenn, hogy a transzformánsokat olyan mennyiségű antibiotikum jelenlétében tartjuk fenn, amely toxikus a nem transzformált sejtekre, így a vektort elvesztett transzformánsok, azaz bármely kovalensen kapcsolt dezoxi-ribonukleinsavat elvesztett setek nem növekszenek, és eliminálódnak a tenyészetből. így a találmány szerinti vektorokat felhasználhatjuk számunkra érdekes, bármely Jezoxi-ribonukleinsav-szekvencia megtartására is. A találmány szerinti eljárással előállított klónozó vektorok és transzformánsok felhasználhatók Streptomyces vagy rokonsejtek segítségével előállított különböző termékek termelésének fokozására, az ezeket meghatározó gének klónozásával. Ilyen tennék lehet például — de nem limitáló jelleggel — a sztreptomicin, tilozin, cefalosporinok, aktaplanin, narazin, monenzin, apramicin, tobramiem, erítroinicin és mások. A találmány szerinti eljárással előállított, szelektálható vektorok felhasználhatók olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia klónozására, jellemzésére és újratermelésére, amelyek gyakorlati szempontból fontos fehérjéket, például humán inzulint, humán proinzulint, humán növekedési hormont, marha növekedési hormont, glukagont, interferont és másokat határoznak meg. Felhasználhatók továbbá gyakorlati szempontból fontos anyagcsere utak enzimfunkcióinak vagy génkifejeződést fokozó, szabályozó elemek klónozására. Ezek az előnyös dczoxi-ribonukleinsav-szekvenciák például olyan dczoxi-ribomikleinsuvak, amelyek származtatott antibiotikumok bioszintézisét meghatározó enzimeket kódolnak, például sztreptomicin, cefalosporín, tilozin, aktaplanin, narazin, monenzin, apramicin, tobramicin és eritromicin rokonve-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
