197044. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces és E.coli sejtekben használható kimer klónozó vektorok előállítására
7 197 044 0 E. coli replikációs origót hordozó restrikciós fragmenst, és továbbá az SCP2 vagy az SCP2* plazmidok repiikációs origót hordozó restrikciós fragmensét tartalmazó vektorhoz. Antibiotikum rezisztenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst használhatunk ezután szelektálható markerként a Streptomyces tra funkció vagy a ezzel összefüggő pock fenotfpus helyett. így a találmány szerinti vektorokhoz tartoznak azok is, amelyek kapcsán nem csak a tra funkciót haszáljuk, vagy ezt és az antibiotikum rezisztenciát meghatározó dezoxi-ribonukleisnav-szegmenst együttesen. Ezenfelül, az egyes antibiotikum rezisztenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szegmensek közé nem csak azokat soroljuk, amelyek az ismertetett kimer plazmidok egy adott helyén helyezkednek el, de azokat is, amelyek hozzákapcsolhatók vagy különböző helyekre beépíthetők, azzal a feltétellel, hogy nem roncsoljuk a replikációs origót vagy más, a plazmid által szabályozott kritikus élettani funkciót. A témában jártas szakember előtt világos, hogy mely helyek előnyösek egy adott dezoxi-ríbonukleinsavszegmens ligálására vagy beépítésére. Az SCP2, SCP21, pBR325 és a pBR322 és más plazmidok különböző restrikciós fragmensei, és a jelen vektorokban jelenlévő különböző antibiotikum rezisztenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szegmensek ligálásra módosíthatók. így például molekuláris linkerek kapcsolhatók egyes, vagy az előzőekben ismertetett dezoxi-ribonukleinsav-fragmensekhez. így ligáláshoz specifikus helyek állíthatók elő. Ezenkívül módosíthatjuk a replikációs origót hordozó restrikciós fragmenseket is oly módon, hogy bizonyos nukleotidokat hozzákapcsolunk, kihasítunk vagy helyettesítünk, amiután tulajdonságok változnak meg, és dezoxi-ribonukleinsav ligáláshoz különböző restrikciós helyek jöhetnek létre. A témában jártas szakemberek a nukleotid-kémia és a genetikai kód ismeretében megállapíthatják, hogy mely nukleotidok cserélhetők, és milyen dezoxi-ribonukleinsav módosítások előnyösek egy adott specifikus cél érdekében. Az SCP2 vagy az SCP2* Streptomyces tra funkciót hordozó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok más sejtekbe átmennek, így transzformált és nem transzformált Streptomyces törzsek keresztezésekor könnyen átlépnek. Ez előnyös, mivel a találmány szerinti vektorok így nemcsak protoplaszt transzformációval, de hagyományos genetikai kereszteződéssel is átvihetők. így a vektorok felhasználhatók olyan Streptomyces törzsek esetén is, amelyekből protoplasztokat nehéz előállítani, ezzel pedig szélesedik azon gazdasejtek köre, amelyekkel genetikai manipulációt és dezoxi-ribonukleinsav klónozást végezhetünk. A találmány szerinti vektorok további előnye, hogy a vektorokkal készített dezoxi-ribonukleinsav géngyűjtemények kényelmesen és gyorsan vizsgálhatók egy adott érdekes gén jelenléte szempontjából, a hagyományosan végzett replikázással. A tra funkció nélkül a dezoxi-ribonukleinsav a géngyűjemény ezernyi klónjából izolálandó, megfelelő törzsekbe transzformálandó és az adott gént tartalmazó kiónokat azonosítanunk kell. Mivel nem rendelkezünk széleskörűen használható, Streptomyces tö zsekben fennmaradó fág vektorokkal, a találmány szerinti tra+ vektorok a lambda bakteriofágé kkal analóg, általános klónozd- és szűrővizsgálatot megengedő kísérleteket tesznek lehetővé az E. ccli génjeinek vizsgálatára használt transzdukciós kísérletekhez hasonlóan. Az adott gének ily módon replikázással könnyen azonosíthatók, és így gyorsan sokszorosíthatók E. coli sejtekben, ahogy azt Zj alábbiakban a 19C(2). példában megadjuk. A találmány szerinti vektorok széles körben használhatók, és sok Streptomyces gazdasejtbe transzformálhatok, különösen olyan gazdasági szempontból fontos restrikciómentes törzsekbe, amelyek antibiotikumokat, például aminoglükozid, n akrolid, ß-laktäm, poliéter és glikopeptid antibiotikumokat termelnek. Ilyen, restrikcidmentes törzseket könnyen szelektálhatunk és izolálhatunk a Streptomyces törzsekből, ismert módon [ .omovskaya és munkatársai, Microbiological Reviews, 44, 206 (1980)]. A restrikciómentes gazdas íjtek nem rendelkeznek restrikciós enzimekkel, és így nem hasítják vagy degradálják a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat a transzformációt követően. A jelen eljárás során azokat a gazdasejteket, amelyek r találmány szerinti vektorok bármely restrikciós helyét nem képesek hasítani, szintén restrikció mentes törzseknek nevezzük. Az alábbiakban ismertetünk néhány olyan előnyös, restrikciómentes Streptomyces törzset, amelyek amino-glükozid-típusű antibiotikumokat termelnek, és amelyekben a találmány szerinti vektorok különösen előnyösen használhatók, és amelyek a vektorokkal transzformálhatok: S. kanamyceticus (kanamicinek), S. chrestomyceticus (aminozidin), 3. griseoflavus (MA 1267 antibiotikum), S. microsporus (SF-767 antibiotikum), S. ribosidificus (SF733 antibiotikum), S. flavopcrsícus (spektinomicin), S. spectabills (aktinospcktacin), S. rimosus forma paromomycinus (paromomicinek, katenu!in), S. fradiae var. italicus (aminozidin), S. bluensis var. bluensis (bluensomicin), S. catenulae (katenulin), S. olivoreticuli var. cellulophilus (desztomicin A), S. tenebrarius (tobramicin, apramicin), S. lavendulae (neonácin), S. albogriscolus (neomicinek), S. albus var. metamycinus (mclamicin), S. hygroscopicus var. sagamiensis (spektinomicin), S. bikiniensLs (sztreptomicin), S. griseus (sztreptomicin), S. erythrochromogenes var. narutoensis (sztreptomicin), S. poonensis (sztreptomicin), S. galbus (sztreptomicin), S. rameus (sztreptomicin), S. olivaceus (sztreptomicin), S. mashuensis (sztreptomicin), S. hygroscopicus var. limoneus (valídamicinek), S. rimofaciens (desztomicinek), S. hygroscopicus forma glebosus (glebomicin), S. fradiae (hibrimicinek, neomicinek), S. eurocidicus (A16316-C antibiotikum), S. aquacanus (N-metilhigromicin B), S. crystallinus (higromicin A), S. noboritoensis (higromicin), S. hygroscopicus (higromicinek), S. atrofaciens (higromicin), S. kasugaspinus (kasugamicinek), S. kasugaensis (kasugamicinek), S. netropsis (LL-AM31 antibiotikum), S. lividus (lividomicinck), S. hofuncnsis (scldomicinkomplex) és S. canus (ribozil-paromamin). A találmány szerinti vektorokat különösen előnyösen használhatjuk, és különösen előnyösen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
