197044. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces és E.coli sejtekben használható kimer klónozó vektorok előállítására
5 197 044 6 nagyságú EcoRI-Sall fragmenséhez. Az utóbbi, a pJL125 plazmid tartalmazza a pSCP2* plazmid legnagyobb (5,4 kb) EcoRI-Sall fragmensét, előállítására a pJL121 plazmidot Sáli enzimmel hasítjuk. A pJL190 és a pJL195 szemléltető jelleggel előállított plazmidok a necmicin rezisztencián kívül a fentiekben ismertetett M fenotípust is meghatározzák. A neomicin rezisztenciát meghatározó fragrncns fonása, a pLR4 plazmid 7,7 kb nagyságú, és előállítására a BamHI enzimmel hasított pBR322 és a pLRl plazmidot ligáljuk. A pLRl plazmid 14,8 kb nagyságú, előállítására a pIJ2 plazmid [Thompson és munkatársai, Nature, 286, 525 (1980)} Hindii! fragmensét hozzákapcsoljuk a pBR322 plazmid HindlII enzimes kezeléssel kapott fragmenséhez. A szakember számára érthetően, a pLR4 és a pLRl plazmid ugyanazt a neomicin rezisztencia gént hordozza, és így a pJL előzőekben ismertetett, neomicin rezisztenciát meghatározó gént hordozó vektorok előállítására mindkettőt felhasználhatjuk. Izoláltunk egy pJL192 jelzésű, szintén neomicin rezisztenciát meghatározó plazmidot oly módon, hogy a Streptomyces griseofuscus sejtekben lévő pJL190 plazmid spontán mutánsát elkülönítettük. A pJL192 plazmid nagyobb mennyiségű neomicinnel szemben biztosít rezisztenciát, és így a pJL190, pJL195, pIJ2, pLR4 és a pLRl piazmidokban jelenlévő, rezisztenciát meghatározó géntől megkülönböztethető, új neomicin rezisztencia gént képvisel. A pJL195 plazmádból spontán mutációval kapott és pJL199 jellel jelölt további neomicin rezisztenciát meghatározó plazmidot izoláltunk. A léniában jártas szakember felismeri, hogy a pJL192 vagy a pJL199 plazmidok új neomicin rezisztencia génjét könnyen kihasíthatjuk, és más vektorokhoz köthetjük. A gén fokozott és hatékonyabb szelekciót tesz lehetővé transzformációt követően. Mint ahogy a pJL190 és a pJL195 plazmidok esetén is, a |úL192 és a pJL199 plazmidok transzformánsai megfelelő indikátor törzzsel együtt tenyésztve kifejezik az M fenotípust. A pJL192 plazmidot az E. coli K12 C600k-M-/ pJL192 törzsből, a törzset letétbe helyeztük a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, állandó törzsgyűjteményében. A pJL192 plazmid forrásaként használható törzset B-15040 sorszámon bárki elkérheti. A pLR2 plazmid 1,35 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmense az egyik olyan íragmens, amely a thiostrepton antibiotikummal szembeni rezisztenciát határozza meg. Ezt a neomicin rezisztenciát hordozó szegmens helyett szintén felhasználhatjuk. A pLR2 thiostrepton rezisztenciát meghatározó fragmenst hordozó plazmid 18,7 kb nagyságú, és a pIJ6 plazmid [Thompson és munkatársai, Nature, 286, 525 (1980)] HindlII fragmensének és a pBR322 plazmid HindlII fragmensének összekapcsolásával állítjuk elő. A pLR2 plazmid E. coli sejtekben funkcionál, és így a manipulációhoz sokszorosítható és könnyen izolálható. Kényelmi okokból és a könnyű előállítás miatt a pLR2 plazmid thiostrepton rezisztenciát meghatározó 1,35 kb nagyságú BamHI fragmensét összekapcsoltuk a pBR328 plazmid BamHI restrikciós helyével, amikor megkaptuk a p.TL193 jelű plazmidot. A pJL193 plazmid 1 kb nagyságú Bell restrikciós fragmense tartalmazza a thiostrepton rezisztenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst. így ligációt követően, például az 52—56. példákban megadottak szerint eljárva, a találmány oltalmi köréhez tartozó vektorokhoz jutunk. A találmány szerinti eljárás során különböző SCP2 és SCP2* restrikciós fragmenseket használhatunk, azzal a feltétellel, hogy az 5,4 kb nagyságú EcoRI-Sall restrikciós fragmensen lévő replikációs origó jelen van. Ilyen további, az SCP2 és az SCP2* plazmádból származó restrikciós fragmens például — nem limitáló jelleggel — a 6 kb nagyságú Suli, a 15 kb nagyságú PstI, a 23 kb nagyságú Bglll, a 15 kb nagyságú BamHI, a 14 kb nagyságú EcoRI-PstI, a 13 kb nagyságú EcoRI-BamHI és a 15 kb nagyságú Pstl-BamHI fragmensek. Ezek a fragmensek tartalmazzák a Streptomyces tra funkciót, és ligálhatók egy olyan E. coli plazmid restrikciós fragmenséhez, amely funkcionális E. coli replikációs origót és antibiotikum rezisztenciát meghatározó restrikciós fragmenst tartalmaz. Ilyen E. coli plazmid például a pBR322, a pBR324, a pBR325, a pBR327 és — többek között — a pBR328 jelű plazmid. így a jelen eljárás nemcsak a példákban a pJL vektorok előállítására használt pBR322 vagy a pBR325 plazmidokra vonatkozik. Bár a leírásban példaként említett neomicin és thiostrepton antibiotikummal szembem rezisztenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szegmensek sorrendben a pLR4 plazmádban jelenlévő, 7,7 kb nagyságú EcoRI-HindlII és a 7,5 kb nagyságú EcoRI-részleges Sáli fragmensek és a pLR2 plazmid 1,35 kb nagyságú BamllI és a pJLL93 1 kb nagyságú Bell fragmensei, a témában jártas szakemberek más olyan dezoxi-ribonukleinsav-szegmenseket is előállíthatnak, amelyek neomicinnel vagy thiostreptonnal szembeni rezisztenciát határoznak meg. A pLR i plazmid további neomicin rezisztenciát meghatározó dezoxi -ribonukleinsavszegmensei például a 3,4 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmense, a 3,5 kb nagyságú PstI restrikciós fragmense és a 3,4 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmens nagyobb Sstl-KpnI szubfragmense. Thiostrepton rezisztenciát meghatározó szegmense továbbá például a pLR2 plazmid 13 kb nagyságú PstI fragmense. A témában jártas szakemberek előállíthatnak más dezoxi-ribonukleinsav-szemgenseket is, amelyek az előzőektől különböző, például higromicin, viomicin, tilozin, eritromicin és más, hasonló antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát határoznak meg. Ezenfelül a fent megadott antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szegmensek különböző funkcionális származékait is előállíthatjuk oly módon, hogy a genetikai kódnak megfelelően hozzáadunk, kihasítunk vagy helyettesítünk bizonyos nukleotidokat. ‘ A találmány oltalmi körébe eső plazmidokat kapunk abban az esetben, ha a fenti származékokat, vagy bármely más, antibiotikum rezisztenciát meghatározó dezoxi-ribonuklelnsav-szegmenst hozzákapcsolunk egy E. coli antibiotikum rezisztenciát meghatározó dezoxi-ribonukleiusav-szegmenst, egy 5 10 15 20 25 3C 35 40 45 50 55 60 65 4
