197044. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces és E.coli sejtekben használható kimer klónozó vektorok előállítására
3 197 044 4 és szelektáljuk azokat a telepeket, amelyek M pock fenotfpust mutatnak. A találmány szerinti vektorok előállítására előnyösen ügy járunk el, hogy az SCP2 vagy SCP21 plazmidból származó, replikációs origót hordozó, és a Streptomyces tra funkciót meghatározó restrikciós fragmenst összekapcsoljuk egy E. coli plazmid E. coli replikációs origót és antibiotikum rezisztenciát meghatározó restrikciós fragmensével. Az SCP2 és az SCP21 plazmid, amelyekből a replikációs origót nyerjük, egyaránt 31 kb nagyságú, és hasonló restrikciós képet mutat. Az SCP2* plazmid az SCP2 plazmidból származik spontán mutációt követően, meghatároz egy szelektálható, úgynevezett telep pock morfológiát. Bár a pock megkülönböztethető az SCP2 plazmid pock-jától, más téren az SCP2 és az SCP2X plazmid gyakorlatilag azonos. Bár a jelen leírásban úgy adjuk meg, hogy a Streptomyces tra funkció és az SCP2 és az SCP2* plazmidok replikációs origója ezek 5,4 kb nagyságú EcoRl-Sall restrikciós fragmcnsén helyezkedik el, egy sor különböző replikációs origót és, Streptomyces tra funkciót kifejező fragmens állítható elő. Ezt úgy érjük el, hogy az 5,4 kb nagyságú EcoRI-Sall régión kívül hasító restrikciós enzimmel emésztünk. Az SCP2* (s így az SCP2) plazmid részletes restrikciós térképét a mellékelt 1. ábrán adjuk meg. Az SCP2 vagy SCP2* plazmid könnyen izolálható a Streptomyces coelicolor A3 (2), illetve a Streptomyces coelicolor Ml 10 törzsekből. A törzseket letétbe helyeztük a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, törzsgyűjteményében. A Streptomyces coelicolor A3 (2), mint az SCP2 plazmid forrása, 15042 sorszámon kapható meg. A Streptomyces coelicolor Ml 10 az SCP2X plazmid forrása, és 15041 sorszámon rendelhető meg. Több olyan restrikciós fragmenst állíthatunk elő az SCP2 és az SCP2X plazmidokból, amelyek tartalmazzák a tra funkciót és a replikációs origót. Szemléltető jelleggel megadjuk például a következőket: az 5,4 kb nagyságú EcoRI-Sall, a 6,0 kb nagyságú Sail, a 19 kb nagyságú EcoRI-HindlII és a 31 kb.nagyságú EcoRI SCP2X plazmid restrikciós fragmense, továbbá az SCP2 plazmid 31 kb nagyságú BglII restrikciós fragmense. Az előzőekben ismertetett SCP2X és az SCP2 fragmenseket az E. coli pBR325 és a pBR322 plazmidok replikációs origót és antibiotikum rezisztenciát meghatározó fragmenséhez kötjük. A témában jártas szakember előtt nyilvánvaló, hogy bár ez nem szükséges, de előnyös, ha az E. coli-ban antibiotikum rezisztenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szegmens és az E. coli replikációs origót hordozó szegmens egyazon E. coli plazmid restrikciós fragmensén helyezkedik el. Kényelmi szempontból és könnyű előállítás érdekében összekapcsoljuk az SCP2* plazmid 31 kb nagyságú EcoRI fragmensét és a pBR325 plazmid 6 kb nagyságú EcoRI fragmensét, amiután megkapjuk a pJL120 és a p.JLl21 plazmidokat. Kél orientációjú rekombináns plazmidot kapunk, mivel a fragmensek mindkét irányban összekapcsolódnak. Az SCP2X 6,0 kb nagyságú Sáli fragmensét és n pBR325 plazmid 6,0 kb nagyságú Sáli fragmensét összekapcsolva megkapjuk a pJL180 és a pJL181 plazmidokat. Ha az SCP2X 5,4 kb nagyságú EcoRI-Sall fragmensét összekötjük a pBR325 plazmid 4,8 kb nagyságú EcoRI-Sall fragmensével, úgy megkapjuk a pJL125 plazmidot. A fenti vektorok mindegyike könnyen szelektálható E. coli és Streptomyces sejtekben. A pJL120 6s a pJL121 plazmid például E. coli sejtekben ampicillin és tetraciklin rezisztenciát határoz meg. A pJL180 és a pJL181 plazmidok ampicillinre és kloramfenikolra rezisztens sejteket határoznak meg. A pJL125 plazmid csak ampicillinnel szembeni rezisztenciát biztosít. így a fenti vektorok kényelmesen szelektálhatok E. coli gazdarendszerben oly módon, hogy a táptalajhoz hozzáadjuk a megfelelő antibiotikumot. Az előzőekben ismertetett vektorok pock fenotípust határoznak meg, így Streptomyces sejtekben könnyen szelektálhatok. A pock fenotípus mérhető jelenség, és ismert [Bibb és Hopwood, J. Gén. Microbiol., 126, 427 (1981)]. A jelenség a lethal zigózis jelenségével és a Streptomyces szexfaktorok tra funkciójával (tra: szexuális átvihetőséget meghatározó gének) függ össze. Az SCP2, SCP2X és az SCP2 és SCP2X származékait tartalmazó transzformánsok három jól megkülönböztethető pock morfológiát mutatnak, megfelelő indikátor törzsre rétegezve. A vad típusú SCP2 és a mutáns SCP2X plazmidok által mutatott telepmorfológiát sorrendben P és p1 betűkkel jelöljük. Mindezideig ismeretlen pock morfológiát kapunk akkor, ha az SCP2 vagy az SCP21 EcoRI restrikciós helyére klónozunk. Ez a beépítés inaktiválja a P gént, és meglepő módon, morfológiailag megkülönböztethető minipock fenotfpust határoz meg. Ezt M jellel jeíöljük. A minipock jelentősen kisebb nagyságú, mint amit az SCP2 vagy az SCP2X okoz. Csak a transzformált Streptomyces sejtek mutatnak M pock fenotfpust, és így a transzformánsok könnyen azonosíthatók és szelektálhatok. A témában jártas szakemberek gyorsan felismerik, hogy a fenti pJL vektorok közül a pJL120, pJL121 és a pJLl25 plazmidok M fenotfpust, a pJL180 és a pJL181 plazmidok p* fenotfpust. A pock fenotípus kifejezésére alkalmas, megfelelő indikátor törzsek ismertek, köztük szerepel a későbbi példákban ismertetett SCP2~ és az SGP2X~ törzs. A találmány szerinti vektorok tehát szelektálhatok és Streptomyces sejtekben kitűnően felhasználhatók. Az előzőekben ismertetett plazmidokat olyan dezoxi-ribonukleinsav-szegmensekkel is elláthatjuk, amelyek Streptomyces sejtekben antibiotikummal szembeni rezisztenciát határoznak meg. Ezek a származékok egy további szelektálható fenotfpust határoznak meg, ilyeneket a továbbiakban szemléltető jelleggel a pJL190 és a pJL195 plazmidok kapcsán ismertetünk. A pJL190 plazmid előállítására a pLR4 plazmid 7,7 kb nagyságú EcoRIHindlII, neomicin rezisztenciát meghatározó fragmensét hozzákapcsoljuk a pJLI21 plazmid 19 kb nagyságú EcoRl-1 Iindllf fragmenséhez. A pJLI95 plazmid előállítására pedig úgy járunk el, hogy a pLR4 plazmid 7,5 kb nagyságú EcoRI-részleges Sáli fragmensét ligáljuk a pJL125 plazmid 5,4 kb 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
