197044. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces és E.coli sejtekben használható kimer klónozó vektorok előállítására
19 197 044 20 lizáljuk. Szuszpendált dezoxi-ribonukleinsav tartalmazza a 35,8 kb nagyságú pJL120 és a pJL121 plazmidokat. Két orientációjú rekombináns plazmidot kapunk, mivel a pBR325 plazmid EcoRí fragmense mindkét irányban beépül. A pJL120 és a pJL121 plazmidok mindegyikének restrikciós térképét a 7. példában megadottak szerint végzett izolálást követően meghatározzuk. A télképet a mellékelt 2. ábrán adjuk meg. 7. példa Az E. coli K12 C600Rk—Mk—/pJL120 és az E. coli K12 C600Rk—Mk—/pJL121 törzsek előállítása A) A fagyasztott, kompetens E. coli KI2 C600Rk—A1k— előállítása Friss, egy éjszakán át való tenyésztéssel előállított E. coli K12 C600Rk—Mk— [lásd Chang és Cohen, Proc. Nat. Acad. Sei., 71, 1030—1034 (1974)] tenyészetet 1:10 arányban átoltunk friss L-táptalajba [lásd Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs., Cold Spring Harbor, New York (1972)]], a tenyésztést 1 órán át 37 ”C hőmérsékleten folytatjuk. 660 Klett egységig folytatjuk a tenyésztést, majd a sejteket összegyűjtjük, 2,5 ml 100 mmólos nátrium-kloridoldattal mossuk, 150 mmólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk a sejteket, az oldatot előzőleg 10% glicerinnel egészítjük ki A tenyészetet 20 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Centrifugálással összegyűjtjük a sejteket, 0,5 ml kalcíumklorid-glicerin-elegyben szuszpendáljuk, 3—5 percen át jégfürdőben hűtjük, majd lefagyasztjuk. A sejtszuszpenziót felhasználásig folyékony nitrogénben tároljuk. Az előkészítés és a tárolás lényegesen nem befolyásolja az élőképességet, és a kovalensen zárt, kör-alakú dezoxi-ribonukleinsawal való transzformáció frekvenciáját. B) Transzformálás A kompetens sejteket jégfürdőben felolvasztjuk, és 0,1 ml sejtet 0,05 ml dezoxi-ribonukleinsav-oldattal keverünk (10 pl, a 6C) példában megadottak szerint előállított minta, 40 pl 0,1 XSSC elegye; ez utóbbi összetétele: 0,015 mól/1 nátriumklorid, 0,0015 mól/1 nátrium-citrát, pH=7). A transzformációs elegyet 20 percen át jégfürdőben inkubáljuk, majd 1 percen át 42 °C hőmérsékleten tartjuk, végül 10 percen át ismét jégfürdőben hűtjük. Ezután 0,85 ml L-táptalajjal hígítjuk a mintákat, és 1,5 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezt követően ml-enként 50 pg ampicillint és 12,5 pg tetraciklint tartalmazó L-agarra szélesztjük a sejtszuszpenziót. A tenyészeteket 18 órán át 37 ”C hőmérsékleten inkubáljuk. A kapott telepeket a várt fcnotfpusra szelektáljuk és vizsgáljuk (AmpR, TetR, CMS). A transzformánsok tartalmazzák az előállítani kívánt E. coli K12 C600Rk-Mk-/pJL120 és az E. coli K12 C600Rk—Mk—/pJL121 sejteket. Ismert módon izoláljuk az ampicillinre és tetraciklinre rezisztens telepeket, tenyésztjük ezeket, és ezután restrikciós enzim-analízissel és agaróz gélelektroforézissel azonosítjuk a konstitutív plazmidokat. Az azonosított transzformánsokat ezután felhasználjuk a pJL120 és a pJL121 plazmidok előállítására és izolálására, ismert módszerek szerint. 8. példa A pJLl80 és a pJL18J plazmidok előállítása A) Az SCP2X plazmid emésztése Sail enzimmel, és a 6,0 kb nagyságú Sail fragmens izolálása Az emésztést a 6. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hegy az EcoRI restrikciós enzim és az ehhez tartozó reakcióelegy helyeit u Sail restrikciós enzimet és a hozzátartozó, ;Jábbi összetételű reakcióelegyet használjuk: 150 mmól nátrium-klorid 80 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5 60 mmól magnézium-klorid 2 mmól etién-diamin-tetra-ecetsav literenként. A reakciót agaróz gél-elektroforézissel ellenőrizzük, annak bizonyítására, hogy az teljesen lejátszódott. Ezután 15 percen át 65 °C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, a reakció leállítására. A kapott Sáli restrikciós fragmenseket agaróz gélelektroforézissel elkülönítjük, és ezután az elkülönült fragmenseket etidium-bromiddal festve ultraibolya fényben vizsgáljuk a fluoreszkáló csíkokat. A 6,0 kb nagyságú, számunkra érdekes fragmens-részt kihasítjuk a gélből, és TBE-pufferba elektro-eluáljuk. A puffer összetétele a következő: 1,6% Sigma 7—9 puffer [Sigma Chemical Company, P.O. Box 14508, St. Louis, Missouri 63178], 0,093% dinátrium-EDTA, 0,55% bórsav. A TBE- pufferban lévő gélfragmenst dialízis zsákba helyezzük, és 1 órán át 100 V feszültségen elektroforézist végzünk. A vizes oldatot elkülönítjük a dialízis zsákból, és DEAE-cellulózoszlopon vezetjük át. A DEAE-cellulózt (DE52) az alábbi cégtől vásároltuk: Whatman Inc., 9 Bridewell Place, Clifton, New Jersey 07014. A 0,5 ml térfogatú DE52- cellulózt egyensúlyi pufferral egyensúlyoztuk ki. Ennek összetétele a következő: 0,1 mól kálium-klorid 10 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,8 (literenént). Az oszlopot 2,5 ml egyensúlyi pufferral mossuk, és a körülbelül 5 pg súlyú dezoxi-ribonukleinsavat 1,5 ml alábbi összetételű eluciós-pufferral eluáljuk: 1 mól nátrium-klorid, 10 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,8 (literenként). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
