197044. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces és E.coli sejtekben használható kimer klónozó vektorok előállítására
21 197 044 Az eluátum nátrium-ion koncentrációját 0,35 mól/ 1-re állítjuk be, és a dezoxi-ribonukleinsavat ezután 2 térfogat (9 ml) 10()%-os etanollal kicsapjuk, majd 16 órán át —20 °C hőmérsékleten tároljuk a szuszpenziót. A dezoxi-ribonukleinsav csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, 75%-os etanollal mossuk, vízmentesítjük és TE-pufferban oldjuk. A továbbiakban a fenti konvencionális izolálás! módszert AGE(DE52) elektroeluációs módszernek nevezzük. B) A pBR325plazmid emésztése Sáli enzimmel Az emésztést a 8A) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pBR325 plazmidot használjuk, és a fragmensekct nem különítjük el prcparalfv AGE(ÜE52) elcktroeluációs technikával. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat TE-pufferban oldjuk, és felhasználásig 4 °C hőmérsékleten tároljuk. C) A Sail enzimmel emésztett pBR325plazmid és a 6,0 kb nagyságú SCP2‘ plazmid Sail fragmensének összekapcsolása 1,5 pg SCP2* 6,0 kb nagyságú Sali fragmenst (lásd a 8A) példát) 0,5 pg, a 8B) példában megadottak szerint előállított 0,5 pg mennyiségű pBR325 Sáli fragmenssel keverünk. A dezoxi-ribonukleinsav keveréket ismert etanolos kicsapással kicsapjuk, majd a csapadékot az alábbi összetételű elegyben oldjuk: 3 pl desztillált víz 4 pl 0,66 mól ATP 3 pl-ligáz-kináz-elegy (0,25 mól/1 trisz-hidrogén-klorid, pH=7,8, 50 mmól/1 magnézium-klorid, 25 mmól/1 ditio-treitol és 25% glicerin) és 1 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz (1 egység). 1 órán át 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 12 pl vizet, 20 pl, 0,66 mólos ATP- oldatot és 8 pl ligáz-kináz-elegyet adunk hozzá. 18 órán át 15 °C hőmérsékleten folytatjuk az inkubálást. A kapott, ligáit dezoxi-ribonukleinsavat 1:5 arányban hígítjuk 0,lxSSC oldattal, amikor megkapjuk a 12,0 kb nagyságú pJL180 és a pJL181 plazmidokat tartalmazó oldatot. Két orientációjú rekombináns plazmidot kapunk, mivel a pBR325 Sáli fragmense mindkét irányban beépülhet. A mellékelt 3. ábrán megadjuk a pJL180 és a pJL181 restrikciós térképet. 9. példa Az E. coli KI2 C600Rk—Mk—IpJL 180 és az E. coli K12 C600Rk—Mk—/pJL 181 előállítása A 7. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a pJL120 és a pJL121 plazmidok helyett a 8C) példában megadottak szerint előállított pJL180 és a pJL181 plazmid dezoxiribonukleinsavakat tartalmazó elegyet használjuk. A kapott transzformáns telepeket a várt fenotípusra (AmpR, Tets, CM11) szelektáljuk, amikor megkapjuk az E. coli K12 C600Rk—Mk—/pJL 180 és az E. coli KI2 06001^—Mk—/pJL 181 jelű transzformánsokat. Ismeri módon izoláljuk az ampicillinre és kloramfenikolra rezisztens telepeket, a sejteket tenyésztjük, majd a konstitutív plazmidokat restrikciós enzim és AGE-analfzissel (agaróz gél-elektroforézissel) azonosítjuk. Az azonosított transzformánsokat a továbbiakban felhasználhatjuk a pJL180 és a pJL181 plazmidok előállítására és izolálására. 10. példa A pJL125plazmid előállítása A) A pJL121 plazmid emésztése Sail enzimmel és a 10,2 kb nagyságú Sail fragmens izolálása Az emésztést a 8. példában megadotttik szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az SCP2X plazmid helyett a pJL121 plazmidot használjuk, és az emésztést annak befejeződése előtt leállítjuk. A kapott Sail restrikciós fragmenst preparatív AGE- módszerrel nem különítjük el, hanem ismert etanolos kicsapással csapadékot képezünk. A restrikciós fragmenseket TE-pufferban oldjuk és azonnal ligáljuk. B) A pJL12l plazmid 10,2 kb nagyságú Sail fragmensének (10,2 kb) ligálása A ligációs reakciót a 8C) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az SCP2* és a pBR325 plazmid Sáli fragmense helyett a pJL121 plazmid Sáli fragmenseit használjuk. A kapott ligáit dezoxi-ribonukleinsav tartalmaz a pJL125 plazmid mellett 12 másik plazmid termékeit is; ezeket később izoláljuk. Bebizonyosodott, hogy ezek a pJL121 további Sáli restrikciós fragmenseit tartalmazzák. A pJL125 plazmidot ismert módon izoláljuk, ez tartalmazza a pBR325 plazmidból származó replikációs origót, tartalmazza továbbá az SCP2* plazmid 5,4 kb nagyságú replikációs origóját hordozó EcoRl-Sall fragmensét. A molekulát TE-pufferban oldjuk, és felhasználásig 4 °C hőmérsékleten tároljuk. A pJL125 plazmid restrikciós térképét a mellékelt 4. ábrán adjuk meg. A restrikciós helyeket olyan plazmid felhasználásával határoztuk meg, amelyet transzformált E. coli KI 2 C60ÜRk—Mk— sejtekből izoláltunk. 11. példa Az E. coli K12 C600Rk —Mk—/pJL 125 előállítása Az előállítást a 7. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pJL12ü és a pJL121 plazmidok helyett a pJL125 plazmidot 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
