197044. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces és E.coli sejtekben használható kimer klónozó vektorok előállítására
1 197 044 2 A találmány tárgya eljárás olyan szelektálható, új rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozd vektorok előállítására, amelyek az SCP2 vagy az SCP2* plazmid funkcionális rcplikációs origót hordozó, ás legalább egyik végén a 15 kb Bam! 11-PstI szakaszban levő DNS-nek megfelelő DNS-szegmensből és a SCP2 vagy a SCP2* 5,4 kb EcoRI-Saíl restrikciós fragmenséből és E. coli sejtekben funkcionális plazmidból származó, funkcionális replikációs origót hordozó és antibiotikum rezisztenciát meghatározó restrikciós fragmensből állnak. A találmány vonatkozik továbbá a transzformánsokra és az előzőekben meghatározott vektorokat tartalmazó transzformánsok kiválasztására. A találmány szerinti vektorok különösen előnyösen használhatók, mivel kicsinyek, alakíthatók és Streptomyces vagy E. coli sejtek transzformál halók velük, és a transzformált sejtek szeleklálhatók. Mivel a klinikailag fontos antibiotikumoknak több mint a felét Streptomyces törzsek termelik, fontos olyan klónozó rendszerek és vektorok kifejlesztése, amelyek használhatók tíz ebbe az ipari szempontból fontos csoportba tartozó mikroorganizmusoknál. Ezekkel a vektorokkal géneket klónozhatunk Streptomyces-ekbe, mind ismert antibiotikum termelésének fokozása, mind pedig új antibiotikumok és antibiotikum-származékok előállítása érdekében. A találmány szerinti eljárással könnyen szelektálhatjuk a transzformánsokat. Mivel a transzformáció igen alacsony frekvenciával következik be, a fenti vizsgálatnak gyakorlati jelentősége van, ugyanis az eljárás segítségével meghatározhatjuk azt a sejtet (sejteket), amelyek a jelenlévő több millió sejt közül felvették a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat. Ez azért fontos, mivel a nem szelektálható dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciák vektorokba építhetők, majd transzformációt követően megfelelő fenotípusos szelekcióval kiválaszthatjuk azokat a sejteket, amelyek tartalmazzák a vektort és a számunkra érdekes, különleges dezoxi-ribonukleinsavszekvenciát, A találmány leírása során az alábbi kifejezéseket használjuk. A pLR'l vagy a pLR4 plazmid 3,4 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmense: a plJ2 plazmidban lévő 3,4 kb nagyságú, neonácin rezisztenciát meghatározó BamHI fragmenssel azonos. AmpR : atnpicillin rezisztens fenotípus Amps : ampiciIlin érzékeny fenotípus TetR : tetraciklin rezisztens fenotípus Tets : tetraciklin éizékeny fenotípus CMR : kloramfenikol rezisztens fenotípus CMS : kloramfenikol érzékeny fenotípus NeoR : neonácin rezisztens fenotípus Neos : neonácin érzékeny fenotípus ThioR : thiostrepton rezisztens fenotípus Tláos : thiostrepton érzékeny fenotípus A NeoR, Neos, ThioR és a THios fenotípus csak a Streptomyces sejtekben való vizsgálat eredményeit jelzi. Az Amp", Amps, TctR, Tcls, CmR és a cms fenotípus az E, coli sejtekben való vizsgálat eredménye. A találmány tárgya eljárás olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok előállítására, amelyek tartalmaznak: 1. replikációs origót hordozó DNS-szegmenst, mely legalábbis az egyik végén megfelel az SCP2 vagy SCP* plazmid —15 kb nagyságú Bam!ll-Psll restrikciós fragmensének, és magában foglalja az SCP2 vagy SCP21 plazmid -5,4 kb nagyságú restrikciós fragmensét, 2. egy több példányban létező E. coli plazmid replikációs origót tartalmazó restrikciós fragmensét, 3. az adott antibiotikumra eredetileg érzékeny E. coli sejteket transzformálva legalább egy antibiotikummal szembeni rezisztenciát átadó egy vagy több dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst, és 4. egy vagy több olyan dezoxi-ribonukleinsavszegmenst, mely Streptomyces tra funkciót és/vagy legalább egy antibiotikummal szembeni rezisztenciát ad át az adott antibiotikumokra eredetileg érzékeny Streptomyces sejteket transzformálva A találmány szerinti rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok előállítására a találmány egy előnyös kivitelezési változata szerint úgy járunk el, hogy az SCP2 vagy SCP2* piazmid funkcionális replikációs origót tartalmazó, és legalább egyik végén a 15 kb BamHI-PstI szakaszban levő DNS-nek megfelelő DNS-szegmensből és a SCP2 vagy a SCP21 5,4 kb EcoRI-Sall restrikciós fragmensét és egy vagy több dezoxi-ribonukleinsavszekvenciát összekapcsolunk. Úgy járunk el, hogy 1. replikációs origót hordozó DNS-szegmenst, mely legalábbis az egyik végén megfelel az SCP2 vagy SCP2* plazmid -15 kb nagyságú BamHl-Pstl restrikciós fragmensének, és magában foglalja az SCP2 vagy SCP2* plazmid -5,4 kb nagyságú restrikciós fragmensét, 2. egy több példányban létező E. coli plazmid replikációs origót tartalmazó restrikciós fragmensét, 3. az adott antibiotikumra eredetileg érzékeny E. coli sejteket transzformálva legalább egy antibiotikummal szembeni rezisztenciát átadó egy vagy több dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst, és 4. egy vagy több olyan dczoxi-ribonukleinsavszegmenst, mely Streplomyces tra funkciót és/vagy legalább egy' antibiotikummal szembeni rezisztenciát ad át az adott antibiotikumokra eredetileg érzékeny Streptomyces sejteket transzformálva, összekapcsolunk. A találmány tárgya továbbá transzformánsok előállítása, és az előzőekben ismertetett vektorokat tartalmazó transzformánsok kimutatása. Úgy járunk el, hogy 1) transzformációs körülmények között Streptomyces sejteket keverünk egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorral, amely vektor tartalmaz a) egy, az SCP2 vagy SCP21 plazmidból származó replikációs origót, és a P gént tartalmazó restfikciós fragmenst, és b) az adott P gén EcoRI restrikciós helyébe beépíted, nem-letális dezoxi-ribonuklcinsav-szckvcnciál, majd 2) az adott Streptomyces sejteket indikátor Streptomyces törzsből készült rétegen növesztjük, b 10 15 20 25 30 35 40 45 5C 55 6C 65 2
