197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára
17 (97043 E) A pSOM7A2A4 plazmid előállítása A pTrp24 plazmidot BglII és ezután EcoRI enzimmel hasítjuk, majd poliakrilamid-gélen elektroforézist és ezt követően elektroelűciót végzünk, amiután olyan LE’(d)-polipeptidet meghatározd kodonokat tartalmazd fragmenst kapunk, amely BglII ragadós véggel és a 3’-kódoid véggel szomszédosán egy EcoRI ragadós véggel rendelkezik. Az LE’ (d)-fragmenst a pSOM7A2 plazmid BglII helyére klónozhatjuk, amikor olyan LE’ polipeptid/szomatosztatin fúziós proteint kifejező terméket kapunk, amely a triptofán promoter/operator szabályozása alatt áll. Ennek érdekében 1. a pSOM7A2-t EcoRI enzimmel részlegesen emésztjük a triptofán promoter/operatoríól távol eső EcoRI hely hasítására, és 2. megfelelően választjuk ki a primer-szekvenciát, annak érdekében, hogy megtartsuk a kodon leolvasási fázisát, és újra létrehozhassunk egy EcoRI hasítási helyet. 16 pg pSOM7A2 plazmidot 200 pl, 20 mmól/1 triszt, pH — 7,5, 5 nnnól/1 magnézíum-kloridot, 0,02 NP40 detergenst és 100 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmazd puffernd hígítunk, és 0,5 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal hasítunk. 15 percen át 37 °C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd fenollal extraháljuk, az extrakciót kloroformmal megismételjük, etanollal kicsapjuk, és ezután BglII endonukleázzal emésztjük. A nagyobb fragmenst poliakrilamid-gélen elektroforézist végezve és ezután eiektnoelúcióval izoláljuk. A fragmens tartalmazza az LE’ polipeptid proximális végét leíró ,,LE’(p)” kodonokat, azaz ez a BgUI helytől felfelé haladva helyezkedik el. A fragmenst a fenti LE’(d)-fragmenshez ligáljuk T4-dezoxi-ribonukleinsav ligázt használva amikor megkapjuk a pSOM7A2A4 plazmidot. Ezzel E. coli 294 törzset transzformálunk, így fúziós protein létrehozására alkalmas sejtet kapunk, amely protein áll az LE- polipeptidből és a szomatosztatinból, és amely kifejeződés a triptofán promoter/operator szabályozása alatt áll. F) A 3’-végen PstI csoportot és az 5’-vágen BglII csoportot és tetraciklin rezisztenciát meghatározó gént tartalmazó lineáris dezoxi ribonukleinsav előállítása A pBR322 plazmidot Hind III enzimmel emésztjük, és a kapott HindllI végeket SÍ nukleázzal emésztjük. Az SÍ nukleázos kezelés során 10 pg HindllI enzimmel hasított pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat 30 pl Sl-pufferban (0,3 mól/l nátrium-klorid, 1 mmdl/1 cink-klorid, 25 mmcl/1 nátriurn-acetát, pH — 4,5) 300 egység SÍ nukleázzal kezelünk 15 'C hőmérsékleten, 30 percen át. A reakciót 1 pl 30XS1 nukieáz stop-oldattal állítjuk le. Az oldat összetétele a következő: 0,8 mól/l trisz-bázis és 30 mmól/1 etilén-diamin-tetraecetsav. Az elegyet fenollal és ezután kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és ezután az előzőek 1 O I U szerint eljárva EcoRI enzimmel hasítjuk. A iragmenst poliakrilamid gél-elektroforézist követő eiektroelúcióva! izoláljuk, a fragmens EcoRI ragadós véggel és egy tompa véggel rendelkezik, kódoló szálja íimidin nukleotiddal kezdődik. A timidinnel kezdődő SÍ enzimmel emésztett HindllI fragmenst hozzá kapcsoljuk Klenow-polimeráz I enzimmel kezelt BglII íragmenshez, így ligádét követően újra létrejön a BgUI restrikciós hely. Az IC) példában megadottak szerint előállított pSOM7A2 plazmidot tehát BglII endonukleázzal hasítjuk, és a kapott BglII ragadós végeket kétszáiúvá alakítjuk a négy dezoxi-mikleotid-trifoszfát jelenlétében Klenow-polimeráz l enzimmel. A kapott terméket EcoRI enzimmel hasítjuk, majd a kis fragmenst poliakrilamid-gélen elektroforézist végezve, és elektroelnálva izoláljuk, amikor olyan lineáris dezoxi-ribonukleinsav-molekulát kapunk, amely tartalmazza a triptofán promoter/operator rendszert, és a BglII helytől felfelé haladva az LE’ proximális szekvenciát („LE’/p/”). A termék egy EcoRI véggel és a BglII hely feltöitése révén egy tompa véggel is rendelkezik. A BglII helyet újralétrehozzuk oly módon, hogy a tompa véget hozzákapcsoljuk a fentiek szerint SÍ enzimmel emésztett Hindii! fragmens tompa végéhez. így a két fragmenst T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz jelenlétében összekapcsoljuk, amiután megkapjuk a pHKYlO kör alakú plazmidot, amit E. coli 294 kompetens sejtekbe transzformálva szaporítunk. A tetraciklinre rezisztens sejtek hordozzák a pHKYlO rekombináns plazmidot, ezeket szelektáljuk, és a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izoláljuk. A terméket BglII és PstI restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, majd a nagy fragmenst poliakrilamid gélen elektroforézist végezve és elektroelúcióval izoláljuk, amiután megkapjuk a PstI és BgUI ragadós végekkel rendelkező lineáris dezoxi-ribonukleinsav-molekulát. Ez a pHKYIO-ből előállított dezoxi-ribonukleinsavfragmens replikációs origint tartalmaz, és így felhasználható a pIA7A4Al plazmid előállítására, amelyben mind a trp LE’-polipeptid fúziós proteint meghatározó gének, mind pedig a tetraciklin rezisztenciát meghatározó gén a tip promoter/operator rendszer szabályozása alatt áll. G) A trp promoter/operator rendszerrel rendelkező lineáris dezoxi-ribonukleinsav előállítása Az 1E) példában megadottak szerint előállított pSOM7A2A4 plazmidot EcoRI, majd ezután PstI enzimmel hasítjuk. A kapott fragmens tartalmazza a trp promoter/operator rendszert, a fragmenst poliakrilamid gél-elektroforézissel és az ezt követő elektroelúcióval izoláljuk. A részleges EcoRI enzimmel való emésztés azért szükséges, hogy olyan fragmenst kapjunk, amely a szomatosztatint meghatározó gén 5’-végével szomszédosán hasított, de nincs hasítva az ampicillin rezisztenciát meghatározó gén és a triptofán promoter/operator szabályozó szakasz között jelenlévő EcoRI helyen. A Psü enzimmel való hasítást követően az ampicillin rezisztenciát meghatározd gén hasad, ezt az IF/ pél-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C 65 10
