197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára
19 197043 20 dában megadottak szerint előállított végső pHKYlO lineáris dezoxi-ribonukleinsav-származékkal való ligációval újra létrehozhatjuk. H) Az inzulin A lánc struktiírgénjének izolálása Az inzulin A lánc struktúrgénjét a pIAl plazmid EcoRI és BamHI emésztésével kapjuk. A plazmid előállítását Goeddel és munkatársai írják le [Proc. Nat. Acad. ScL, USA, 76, 106 (1979)]. Az előállítandó fragmenst poliakrilamid gélen elektroforézist és ezután elektroelúciót végezve tisztítjuk, a fragmens EcoRI és BamHI végekkel rendelkezik. I) Az inzulin A lánc struktúrgénjének, a triptofán promoter/operator rendszernek és a PstI és BglII végekkel rendelkező pHKYlO lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmens ligálása Az inzulin A láncot meghatározó stuktúrgént, a triptofán promoter/operator rendszert tartalmazó, az 1G) példa szerint előállított lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst és az 1F) példában megadottak szerint előállított pHKYlO lineáris dezoxi-rubonukleinsav-fragmenst megfelelő orientációban összekapcsoljuk, ahogy azt az 1. ábrán megadjuk, így megkapjuk a pIA7A4Al plazmidot. A pIA7A4Al plazmid könnyen szelektálható, mivel az apicillin és tetraciklin rezisztenciát meghatározó szakaszok újra képződnek. 2. példa A pIB7A4Al plazmid előállítása Az 1A/-J/ példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az inzulin A láncot meghatározó struktúrgén helyett az inzulin B láncot meghatározó strukbárgént használjuk a végső ligáláskor. Az inzulin B láncot leíró struktúrgént a pIBl plazmid EcoRI és BamHI emésztésével kapjuk, a plazmidot Goeddel és munkatársai írják le (1979). Az inzulin B láncot meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst poliakrilamid gél-elektroforézissel és elektroelúcióval tisztítjuk, a fragmens EcoRI és BamHI végekkel rendelkezik. A pIB7A4Al plazmidot a 2. ábrán mutatjuk be, a plazmid könnyen szelektálható, mivel ampicillin és tetraciklin rezisztenciát meghatározó génjei újra létrejönnek. 3. példa A pPR3 plazmid előállítása A) A cl, rex és a cro gén egy részét meghatározó lambda bakteriofág 2,5 kb nagyságú BglH restrikciós fragmensének izolálása A lambda cI857 bakteriofágban lévő több BglII restrikciós hely és a pIB7A4Al plazmidban lévő egyetlen BamHI restrikciós hely lehetővé teszi azt, hogy a bakteriofág fragmenseit klónozzuk a pIB7A4Al klónozó vektorba. A lambda cl857 bakteriofág hat olyan helyet hordoz, amely érzékeny BglII enzimre. A BglII fragmensek egyike 2,5 kb nagyságú, tartalmazza a lambda cl gént és a lambda rex gént is [Szybalski és Szybalski, Gene, 7,217—280 (1979); és O’Brien, Genetic Maps, 1. kötet (1980 március); N1HJ. A BglII fragmensek S’-irányban meghosszabbított GATC-szekvenciát tartalmaznak, erek komplementerek a BamHI fragmensek 5’vágével A pIB7A4Al humán inzulint meghatározó plazmid egyetlen olyan helyet tartalmaz, amely Bam- III endonukleázzal hasítható. A BamHI helybe klón ózva a tetraciklin rezisztencia gén a pIB7A4Al plazmidban inaktiválódik. A BglII fragmensek és a BamHI fragmensek ligációját követően az alábbi szekvenciákat tartalmazó rekombinánsok jönnek létre: AGATCC GGATCT TCTÄGG 7387 CCTAGA. Ezek a szekvenciák BglII vagy BamHI enzimekkel nem hasíthatok. Ezért a két enzimmel való hasításkor mindegyik ligációs fragmens eliminálódik, kivéve azt, amelyik egy lambda BglII fragmenst tartalmazó a pIB7A4Al plazmid BamHI helyébe építve. A restrikciós enzimeket ismert forrásokból szereztük be, ezeknek a cégeknek a címét az 1A) példában adjuk meg; az enzimeket ismert módszerek szerint használjuk. Megemlítjük, hogy a használatukkal kapcsolatban az előállítható is mellékel utasításokat. A lambda cI857 sus S, dezoxi-ribonukleinsavat 37 °C hőmérsékleten hasítjuk olyan reakcióelegyben, amely 100 pg dezoxi-ribonukleinsavat, 12 mmól trisz-hidrogén-kloridot (pH — 7,5), 12 mmól magnézium- kloridot, 12 mmól 2-merkapto-etanolt és 100 egység BglII restrikciós enzimet tartalmaz 1 ml térfogatban. A restrikciós fragmenseket agaróz gélen végzett elektroforézissel különítjük el. Az elkülönült fn gmenseket a gélen etidium-bromiddal festjük meg, és ultraibolya fényben fluoreszcencia alapján figyeljük meg. A számunkra érdekes, 2,5 kb nagyságú fragmenst kihasítjuk a gélből, és TBE-oldatba elektroeluáljuk, ahogy azt az 1A) példában megadtuk. A vizes oldatot összegyűjtjük a dialízis után, és DEAE-cellulór oszlopon vezetjük át. Gyantaként 0,5 ml Whatman DE52 gyantát használunk (Whatman Inc., 9 Bridewell Place, Clifton, New Jersey 07014). Az oszlopot egyensúlyozó pufferral egyensúlyozzuk ki, ennek összetétele a következő: 0,1 mól/1 kálium-klorid, 10,0 mmól/I trisz-hidrogén-klorid, pH — 7,8. Az oszlopot 2,5 ml egyensúlyi pufferral mossuk, és a 1 örülbelül 5 pg súlyú dezoxi-ribonukleinsavat 1,5 ml, az alábbiakban megadott összetételű eluáló pufferral eluáljuk: 1 mól/I nátrium-klorid, 10 mmól/1 trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,8. Az eluátumhoz annyi nátrium-kloridot adunk, hogy a nátrium-ion koncentrációja 0,35 mól/1 legyen. Ezután 2 térfogat (körülbelül 9 ml) 100%-os etanol adagolásával kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat, majd 16 órán át —20 °C hőmérsékleten tartj uk a szr szpenziót. A dezoxi-ribonukleinsav csapadékot 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
