197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára
coli K12 RV308/pPR18, E. coli K12 CÓOü/ pPR18 és az E. coli K12 C600Rk-Mfc-/pPR18 sejtek plazmíd nélkül nem túlélők. A törzsek plazmidmegtartási képességének összehasonlításakor világosan kiderül, hogy a találmány szerinti törzsek gyakorlatilag összes élő sejtje tartalmazza az adott plazmidot. Ezenkívül az E. coli K12 2941ambdacl90/PPR18, E. coli K12 RV3081ambdacI90/ pPR18, E. coli K12 C60ülambdacI90/pPR18 és az E. coli K12 C600RkMk-lamhdacl90/pPR18 törzsek nemcsak megtartják a plazmidokat, de termelik az adott fuzionált génterméket is. Az új pPR12 plazmid transzformálható több gazdasejtbe, például az E. coli K12 G600Rk-Mksejtekbe. A kapott törzseket a pPRÍ7 és pPRIS transzformánsokhoz hasonlóan lizogenizálhatjuk, amikor plazmid nélkül elpusztuló törzseket kapunk. így az előállított E. coli K12 C600RK-MK- lambdacI90/pPR12 törzs igényli a pPR12 plazmid. megtartását, míg az előállított E. coli K12 C600Rk- Mk-/pPR12 törzs plazmid nélkül is túlélő. A törzsek plazmidmegtartásának összehasonlításakor világosan kiderül, hogy a találmány szerinti élő sejtek mindegyike tartalmazza az adott plazmidot. A találmány szerinti eljárás szemléltetéséhez használt lambdací857 represszor gén hőmérsékletérzékeny, és 38—44 °C hőmérsékleten, vagy ennél magasabb hőmérsékleten inaktiválódik. így, ha 38 °C hőmérséklet és 44 “C közötti hőmérsékletre helyezzük a sejteket, azok a lambdaprofág lírikus ciklusának indukálódása következtében lizálnak, mivel a találmány szerinti eljárás értelmében a gazdasejtek ezt a profágot tartalmazzák. Ahogy az könnyen érthető, ha a gazdasejt lízisét okozó letális vagy kondicionálisan letális markert represszáló hőmérséklet-érzékeny represszort használunk, továbbá, ha a gazdasejteket a represszort inaktiváló hőmérsékleten tenyésztjük, úgy kondicionálisan letális marker esetén azon a hőmérsékleten, amely nem esik a gazdasejt szaporodását lehetővé tevő hőmérsékletértékek közé, a találmány szerinti továbbfejlesztett szelekciós módszer egyszerű, kényelmes és olcsó eljárást biztosít a sejten belüli termékek tisztításához a sejtek lízisével. Ahog>r azt leírjuk, a találmány szerinti eljárás során olyan plazmidon lévő gént használunk fel, amely egy letális kromoszomális markért represszál. A sejtek szelektálása független a replikontól, és ugyancsak független a plazmidon lévő többi géntől, bár a találmány szerinti eljárás előnyös kivitelezési változata szerint előnyösen a lambdacI857 bakteriofág cl-t tartalmazó 0,9 kb nagyságú Pstl-HincII restrikciós fragmensét használjuk, használhatjuk azonban bármely más, olyan lambda bakteriofág törzs 0,9 kb nagyságú Pstl- HindcII, cl-t hordozó restrikciós fragmensét, amely funkcionális represszort határoz meg. Továbbá, a találmány szerinti eljárás szemléltetésekor lambda cI90 mutációt hordozó profágot használunk, és így az nem termel funkcionális lambda cl represszort, használhatunk bármilyen olyan lambda bakteriofág mutánst is, amely funkcionális cí represszor gént nem tartalmaz. Nyilvánvaló, hogy ezek a mutánsok 7 a lizogen állapot fenntartására más represszorforr.lst igényelnek. A találmány szerinti szelektív módszerrel egy funkcionális polipeptid kifejeződése fokozódik, és rz eljárás kiterjeszthető különböző termékeket kifejező plazmidon lévő géneket tartalmazó gazdasejtekre is. A plazmidon lévő gén például lehet egy természetben előforduló gén, nem természetes gén vagy egy olyan gén is, amely részben természetes, részben pedig szintetikus vagy nem természetben előforduló. Részletesebben szólva, a találmány szerinti eljárást felhasználhatjuk humán pre-proinzu- 1 nt, humán proinzulint, humán inzulin A-láncot, humán inzulin B-láncot, humán növekedési hormont, nem humán növekedési hormont, nem humán inzulint, humán interferont, nem humán interferont, vírus antigént, urokinázt, bármely peptid hormont, bármely enzimet, bármely polipeptidet vagy gyakorlatilag bármely kutatási vagy gyakorlati értékű gén terméket meghatározó gént hordozó plazmidot tartalmazó sejtek szelektálására és fennl irtására. A találmány szerinti eljárás egy adott kivitelezési táltozata szerint a plazmidreplikációt és a génternékek kifejeződését sorrendben a pMBl-ből származó replikonnal (lásd Bolivar, Life Sei., 25, 807— 818, 1979) és a trp promoterrel határozzuk meg. Más replikonokat és promotereket is felhasználhatunk mindaddig, míg azok E. coli K12 sejtekben működnek, és a használt adott represszorra nem érzékenyek. A szakemberek számára érthető és hönnyen meghatározható, hogy mely replikonok és promoterek funkcionálnak E. coli K12-ben, és melyek érzékenyek egy adott represszorra. Más replihonok például — de nem limitáló jelleggel — az alábbiak: a ColEl, NRl, PK2, RK6, psCIOl, RP1, RP4, F és más, például E. coli K12 sejtekben i eplikálódó bakteriofágokból származó replikonok. Promotorként használhatunk például — de nem limitáló jelleggel — lac promotert, lipoprotein promotert, riboszomális protein vagy ribonukleinsav promotereket, illetve gyakorlatilag bármely más promotert. Érthető módon előállíthatunk más replikonokat és promotereket is. Azonkívül, hogy az E. coli K12 előnyös gazdája a lambda bakteriofágnak, a törzsről több genetikai (s biokémiai ismeretünk van, így ez a találmány szerinti eljárás során előnyösen használható. Bár előnyösen az E. coli K12 RV308 törzset használjuk, a találmány szerinti eljárás nem korlátozódik egy nemre, fajra vagy törzsre, de alkalmazható bármely E. coli-ra, amelyben a lambda bakteriofág lizogén, és amelybe funkcionális represszor klónozható. A találmány szerinti eljárás összes kivitelezési változata azzal a közös tulajdonsággal rendelkezik, hogy nem érzékeny a táptalajra. Így a találmány szerinti eljárást alkalmazva a termelés fokozására nagyszámú fermentációs változtatást végezhetünk. Az alábbi példákkal tovább szemléltetjük a találmány szerinti eljárást. A példák előnyös kivitelezési ' áltozatok, de a találmány oltalmi körét"nem szűkítik. 8 197043 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
