197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára
9 197043 10 1. példa A pIA7A4Al plazmid előállítása A) A pBRHtrp plazinid előállítása A pGMl plazmid hordozza az E. coli triptoíán operont, amely viszont ALE1413 deléciót tartalmaz [Miozzari és munkatársai, J. Bacteriology, 1457— 1466 (1978)] és ezáltal kifejez egy olyan fúziós proteint, amely tartalmazza a trp vezető szakasz első 6 aminosavát, és körülbelül a trp E polipeptid utolsó harmadát (a továbbiakban LE jellel jelöljük), tartalmazza továbbá a teljes trp D polipeptidet, és ezek mind a trp promoter operator rendszer szabályozása alatt állnak. Az E. coli K12 W311Otna2trpA102/pGMl törzset az Americal Type Culture Collection törzsgyűjteményében letétbe helyeztük ATCC 31622. sorszám alatt. A pGMl plazmidot a törzsből könnyen elkülöníthetjük, és felhasználjuk az alábbi kísérlethez. 20 pg plazmidot Pvull restrikciós enzimmel kezelünk, az enzim a plazmidot öt helyen hasítja. A restrikciós és más enzimeket az alábbi forrásokból szerezzük be: Bethesda Research Laboratories Inc. Box 6010, Rockville, Maryland 20850. Boehrínger Mannheim Biochemicals 7941 Castleway Drive P.O. Box 50816, Indianapolis, Indiana 46250. Research Products Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana, 46515. A génfragmenseket EcoRI linkerekkcl kombináljuk (ezek önmagukkal komplementer alábbi oligonukleotid-szekvenciát tartalmaznak: pCATGAATTCATG), ily módon egy EcoRI hasítási helyet kapunk, és így a későbbiekben a plazmidba klónozhatunk. A pGM 1-ből kapott 20 pg-nyi mennyiségű dezoxi-ribonukleinsav fragmenst 10 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük, 20 pikomól 5’-foszforilezett, szintetikus oligonukleotid (pCATGAATTCATG) és 20 pl T4 dezoxi - ribonukleinsav - ligáz - puffer jelenlétében. A ligáz-puffer összetétele a következő: 20 mmól/1 trisz, pH—7,6 0,5 mmól/1 ATP, 10 mmól/1 magnézium-klorid, 5 mmói/1 ditio-treitol. Egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. Ezután 10 percen át 70 “C hőmérsékleten tartjuk az oldatot, a ligálás megállítására. A linkereket EcoRI enzimmel való emésztéssel hasítjuk, és az EcoRI végekkel rendelkező fragmenseket 5% poliakrilamidot tartalmazó gélen elektroforézissei szeparáljuk. A három legnagyobb frag. menst oly módon izoláljuk a gélről, hogy először etidium-bromiddal festjük, és ezután a fragmenseket ultraibolya fényben megfigyelve kihasítjuk a gélből. A fragmenseket 300 pl 0,lxTBE-vel dialízis zsákba helyezzük, és 1 órán át 0,1 XTBE-pufferban 100 V-on elektroforézist végzünk. A TBE-puffer összetétele a következő: 10,8 g trisz-bázis, 5,5 g bórsav, 0,09 g dinátrium-etilén-diamin-tetraecetsav, és 1 1 víz. A vizes oldatot összegyűjtjük a dialízis zsákokból, fenollal extraháljuk, az extrakciót kloroformmal megismételjük, és 0,2 mól nátrium-klorid végtérfogatot alakítunk ki. Etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribomikleinsavut és vízben oldjuk. Az alábbiakban megadottak szerint azonosítjuk az EcoRI ragadós végekkel rendelkező trp promoter/operatorrendszert tartalmazó gént. Az azonosítást úgy végezzük, hogy a fragmenseket tetraciklinre érzékeny plazmidba építjük be, amely a promoter/operator beépülést követően tetraciklin rezisztenciát fog meghatározni. Az összes dezoxi-ribonukleinsavfragmenst a továbbiakban poliakril-amid gél-elektroforézissel és a fentiekben megadott elektro-eluciós módszerrel izoláljuk. B) A Trp promoter/operator szabályozása alatt tetraciklin rezisztenciát kifejező pBRH trp plazmid előállítása és az előzőekben az A) példában megadottak szerint izolált Trp promoter/operator rendszert tartalmazó dezoxi-ribonuklein-fragmens azonosítása és sokszorosítása A pBRIIl plazmid (Rodriquez és munkatársai, Nucleic Acids Research, 6, 3267—3287, 1979) ampicillin rezisztenciát határoz meg, és tartamazza a tetraciklin rezisztencia gént, de — mivel nincs promoterhez kötve — ezt a rezisztenciát nem fejezi ki. így a plazmid tetraciklin-érzékeny. Az EcoRI helyre promoter/operator rendszert beépítve a plazmid tetraciklin rezisztenciát fog meghatározni. A pBRHl plazmidot EcoRI enzimmel hasítjuk. Az enzimet fenolos exirakcióval távolít)uk el, majd kloroformos extrakciót követően a dezcxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapással izoláljuk. A kapott dezoxi-riboavukleinsav molekulát egy másik reakcióelegyben az 1A) példában megadottak szerint előállított három dezoxi-ribonukleinsav-fragmenssel kötjük össze, az előzőekben megadott módon T4 dezoxi-ribónukleinsav ligází használva. A reakcióelegyben jelenlévő dezoxi-ribonukleinsawal kompetens E. coli K12 294 sejteket (Backman és munkatársai, Proc. nat. Aead. Sei., USA, 73, 4174-4198, 1976; ATCC 31.446.) transzformálunk ismert módszenei (Hershfield és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 71, 3455—3459, 1974) és a baktériumokat LB-lemezekre (Miller, 1972) szélesztjük, a táptalaj ml-enként 20 pg ampicillint és 5 pg tetraciklint tartalmaz. Több tetraciklinre reziszíens telepet szelektálunk, és ezekből izoláljuk a pBRH trp jelíel jelölt plazmid dezoxi-ribonukleinsavat. Az adott fragmens jelenlétét restrikciós enzim-analízissel bizonyítjuk. A pBRH trp plazmid (LIaktamáz-aktivitást határoz meg, ampicillin rezisztenciát biztosít és a trp pro-5 10 15 20 25 3C 35 40 45 50 55 60 65 6
