197042. lajstromszámú szabadalom • Eljárás állati eredetű sejtek tenyésztésére
13 197042 14 2. táblázat A tápanyag hatása rágcsáló hibridoma sejtvonalak és I tanán EB V-transzformált sejtvonal által antitesthozamra szakaszos tenyészetben Sejtvonal Antitestosztály Antite: adalékolt szakaszos ■hozam mg/liter nem adalékolt Arány adalékolt: nem adalékolt 1. (rágcsáló) IgG 86 17 5:1 2. (rágcsáló) lgM 295 99 3:0 3. (rágcsáló) IgG 73 10 7:3 4. (rágcsáló) IgG 100 29 3:5 5. (rágcsáló) IgG 260 68 3:8 6. (rágcsáló) lgM 112 23 4:9 7. (rágcsáló) IgG 200 34 5:9 8. (rágcsáló) IgG 350 1 10 3:2 9. (humán) IgG 53 32 1:7 4. példa Ez a példa egy mieloma-sejtvonal előállítását ismerteti, amelyet tPA-t (szöveti plazminogén aktivátor) kódoló génnel stabilan transzficiáltunk, és ennek a sejtvonalnak a találmány szerinti szakaszos tenyésztését. 1. Vektorszerkesztés 1.1. Szöveti plazminogén aktivátor (tPA) cDNS expressziós szerkezetek A szerkesztéshez használt módszereket Maniatis és munkatársai [1982] írták le részletesen. A tPA- specifikus DNS szekvenciák egy Bowes-meianoma gyűjteményből izolált két cDNS kldnből származnak [Harris és munkatársai, 1986], A ptPA A3 plazmid szerkesztése úgy történik, hogy HindllI íinkereket adunk a tPA cDNS 1200 bázispár (bp) hosszúságii fragmentumához [9—1197 nukieotid; Fennica és munkatársai, 1983 . A cDNS-t ezután beklónozzuk a pAT153 egyet en HindllI helyére. A ptPA21 plazmid szerkesztésénél ügy járunk el, hogy egy BglII cDNS fragmentumot (187—2166 nukieotid) egyetlen BglII hellyel rendelkező plazmidba építünk be. Egy teljes hosszúságú tPA cDNS gént úgy állítunk elő, hogy a ptPA21-bői származó BglII fragmentumot beklónozzuk a ptPA A3 BglII helyére. A keletkező ptPA 3/21 plazmid a következő szekvenciákat tartalmazza: egy 76 bp hosszúságú 5’ nem-kódoló szekvenciát, a tPA teljes kódoló szakaszát, egy 393 bp hoszúságú 3’ nem-kódoló szekvenciát és a tPA kódoló szakaszból egy ismétlődő szegmentumot (187—1197 nukieotid), s mindezt egyetlen HindllI fragmentumon. Egy második plazmidot — jele: p81/ll — is szerkesztünk, amelyben ezt a HindllI fragmentumot a pAT153 szekvenciákhoz viszonyítva megfordítjuk. A p81/ll plazmidot Ball-gyel megemésztjük és a Ball fragmentumot — amely a 3’ nem-kódoló szekvencia 116 nukieotidját, a tPA kódoló szakasz 25 ismétlődő szegmentumát és néhány pAT153 szekvenciát tartalmaz — eltávolítjuk, s így kapjuk a pBSI plazmidot. Egyedi BamHI és Sáli restrikciós enzim helyeket építünk be újra a pBSI-be úgy, hogy a pAT153-ból származó 275 bp hosszúságú 30 BamHI/SalI fragmentumot — melynek kohéziós „ragadós” végeit DNS polimcráz segítségével betöltöttük — beépítjük ligáz segítségével a Ball helyre. Attól függően, hogy a fragmentumot milyen irányítottsággal kapcsoltuk be, vagy egy Sáli helyet 35 (pBS17), vagy egy BamHI helyet (pBS18) alakítottunk ki a tPA gén 3’ végén. A pBS18 plazmid a prekurzora a tPA cDNS expressziós szerkezeteknek. 40 1.2 Egér metallotionein (MMT—I) promoter A 28-as klón [Dr. D. Hamer; National Institute of Health, Bcthcsdn, Maryland, USA] egyik Bam- 45 Ili helyére van beklónozva a teljes SV40 genom és egy 3,8 Kb (kilo-bázispár) hosszúságú EcoRI fragmentum, amely az egér metallotionein I (MMT—I) gént [Hamer és Walling, 1982] tartalmazza az EcoRI helyre beépítve. Ez a plazmid szolgáltatja az 50 MMT—I promotert (MMT) a tPA expressziós szerkezetben. Az egyetlen BglII helyet, amely a transzláció kiindulási pontjától 4 bp-al felfelé helyezkedik el [Glanville és munkatársai, 1981], HindllI hellyé konvertáljuk a CCAAGCTTGG oligonuk- 55 leotid segítségével. A MMT promotert tartalmazó 28-as klónból származó 2,0 Kbp hosszúságú Hindii! fragmentumot a pBS18 egyetlen HindllI helyére építjük be, s /gy alakul ki a transzkripciós kapcsolat az MMT 60 promoter és a tPA kódoló szekvencia között. Ezt a plazmidot pBS18M3-nak neveztük el. Az SV40 poliadenilációs helyet tartalmazó, a 28-as kiónból származó 243 bp hosszúságú Bamlll/Bcll fragmentumot beépítjük a pBS18M3 BamHI helyére. 65 A poliadenilációs helyet a korai — késői irányba
