197042. lajstromszámú szabadalom • Eljárás állati eredetű sejtek tenyésztésére
15 orientáljuk, s ezzel újból létrehozunk egy Bandii helyet a tPA géntől távol. Ennek a piazmidnak a jele p3.16. 1.3 A Rous-sarcoma vírus hosszú, terminális ismétlődő szekvenciája A Rous-sarcoma vírus (RSV) hosszú, terminális ismétlődő szekvenciáját (long terminal repeat = LTR) mint Clal/HindlII fragmentumot izoláljuk a pRSVcat-ből [Gorman és munkatársai, 1982]. Egy MboII helyet konvertálunk Clal hellyé a GGATCGAI'CC oligonukleotid segítségével. A fragmentumot egyedileg beklónozzuk az előzőleg Clal-gyel és Hindllí-mal hasított p3.16 plazmidba, úgy, hogy az MMT promoter! a retrovirus LTR promoterével helyettesíthessük. A keletkező plazmidot, mely az RSV LTR-t tartalmazza, pRSV3-nak neveztük el (lásd a 3. ábrát). 1.4 Szelekciós markerek és más funkcionális fragmentumok A gén, amely a domináns szelekció biztosításáért felelős, a pSV2 neoplazmidból származik [Southern ás Berg, 1982], A G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciát alkalmazzuk, amelyet a pSV2 neoplazmid („neo”) transzkripciós egysége révén kapunk meg. Abból a célból, hogy a „neo” transzkripciós egységét használhassuk, újra klónozzuk, hogy mind a BamHI, mind a Hindii! fragmentumot magába foglalja. Ezeknek a vektorszerkezeteknek a kiindulási alapja a pSV2 B globin (3. ábra), [Southern és Berg, 1982]. A vektor HindlII helyét Bglll hellyé konvertáljuk, majd a keletkezett B globin tartalmú Bglll fragmentumot eltávolítjuk. Az így kapott pSV2 Bglll plazmád alkotja a következő lépés kiindulási pontját, amikor is a PvuII helyet HindlII hellyé konvertáljuk és így jutunk a pSV3M plazmidhoz. A „neo” génnek a pSV3M plazmidba való bejuttatását úgy végezzük, hogy a Bglll—BamHI poliA- splice gén-fragmentumot a pSV2 neoplazmidból izolált BgllI/BamHI fragmentummal helyettesítjük, így kapjuk a pSV3Mne plazmidot. Ez a plazmid tartalmazza most már — a HindlII—BamHI fragmentumon belül — az SV40 korai promoterét, amely a poliA szekvencia nélküli „neo” gén kifejeződést vezérli. A pSV3Mne HindlII és BamHI helyét külön-külön BamHI, illetve HindlII hellyé konvertáljuk, és így létrehozzuk a pSV3Bne, illetve pSV3MMne plazmidokat (3. ábra). Abból a célból, hogy a pRSV3-at stabil sejtvonalak létrehozására használhassuk — BPV vektor által nyújtott szelekció hiányában — egy szelekciós markért vezetünk be a BamHI helyre. Az alkalmazott szelekciós kazetta a pSV3Bne BamHI fragmentuma volt, s a pPRI és pPRII termelő plazmidok, amelyekben a BamHI fragmentum mindkét irányban jelen volt. 2. Transzfekció Transzfekcióhoz az YB2/3.0—Ag20 sejtvonalat [GB2Ü79313 számú brit szabadalmi leírás] használjuk. A scjtvonalat a Dulbccco által módosított Eagle tápoldatban (DMEM; Gibco Ltd.] tartjuk fenn, melyet penicillinnel (50 E/ml), sztreptomicinnel (50 pg/ml), 1 mmól piruváttal, 2 mmól L-glutaminnal és 10%, hővel inaktiváit, magzati botjúszérummal egészítünk ki. A DNS-nek mieloma sejtekbe való bevezetéséhez standard módszereket alkalmazunk, DEAE- dextrán, kalcium-foszfát és clektroporáció [Banerji és munkatársai, 1983; Graham és Van der Eb, 1973; Potter és munkatársai, 1948] használatával. A transzfekciók nagy részét egy módosított DEAE-dextrán módszerrel végezzük, dimetil-szulfoxid (DMSO) törzsoldaUal [Lopala és munkatársai, 1984] és klór-kininnel [Lathman és Magnus-, son, 1983], hogy javítsuk a transzfekciók hatékonyságát. Transzfekció után a sejteket általában 24 óra hosszat állni hagyjuk, mielőtt a szelekciót megkezdenénk. A pSV3Bne plazmidból származó származó „neo” gén kazettát tartalmazó plazmid szerkezetekkel transzficiált sejteket a G418 antibiotikumot [Geneticin; Gibco Ltd., Schering Corp., 3959 254 és 3 997403 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] használva szelektájuk, 1,4 mg/ ml koncentráció mellett. A szelektálás megindítása után a sejteket további 24—48 órán át hagyjuk megint inkubálódni, mielőtt kiönfjarténk mikrotitráló lemezekre a klón-szelekció elvégzéséhez. Ezeket a mikrotitráló csészéket általában 2—3 hétig inkubáljuk, míg az első klóitok megjelennek. A klőnokat telítésig hagyjuk növekedni (amíg a táptalajban levő fenolvörös sárgára nem színeződlk), és ezután vizsgáljuk a felülúszót vagy osztjuk szét 24 tartályos szövcltcnyésztő csészékbe. A használható szintű tPA termelést mutató transzficiált sejtvonalakat (100 pg/ml-nél többet termelő) folyékony nitrogénben lefagyasztva tároljuk, de előbb a táptalajhoz 10% DMSO-t adunk. Ezeket a sejtvonalakat újra klónozzuk, kiválasztjuk a legjobban termelő sejteket, és ezeket úgy tároljuk, mint fent leírtuk. 16 3. A tPA protein mennyiségi meghatározása A sejtvonalak által termelt tPA-t vagy fibrinolízis segítségével vagy enzim-immunoszorbens assay-vel (EL1SA) határozzuk meg. A táptalajban levő aktív tPA-t a Cederholm—Williams által módosított fibrin-agaróz-lemez módszerrel határozzuk meg. LGT agarózt (20 mg/ml) olvasztunk fel 0,1 mól trisz (pH=7,4), 0,15 mól NaCl és 2 mmól CaCl2-tartalmú oldatban, majd lehűtjük 55 °C-ra, s ezután azonos mennyiségű fibrinogént (2 mg/ml 0,9 súly/térfogat%-os NaCl-oldatban), és humán plazminogént adunk hozzá 10 pg/ml végkoncentrációig. A fibrin polimerizációját bovin tíombin hozzáadásával, 0,12 E/ml-ig, indítjuk meg. A keveréket poliészter lemezekre öntjük ki és hagyjuk, hogy az agaróz meg-197042 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
