197042. lajstromszámú szabadalom • Eljárás állati eredetű sejtek tenyésztésére
3 197 042 4 hogy tápanyagok folyamatos adagolása egy állati eredeti! sejttenyészethez, elsősorban ha az adagolást hosszabb időn keresztül végezzük, jelentősen növeli a termékhozamot, ha a tenyésztést a csökkenő fázisban is folytatjuk. A várakozással ellentétben, a tápanyagok beadagolásának a folytatása a maximális csfraképes sejtpopuláció sűrűségét nem növeli, hanem ehelyett a tenyészet csfrázóképességét meghosszabbítani látszik azon a ponton túl, amelynél a csökkenő fázis kezdődne egy tápanyaggal nem adagolt tenyészetben, s így a termékképződés szintje nő. Azt találtuk, hogy az energiaforrásokat és aminosavakat tartalmazó kombinált tápanyag a termék összes kitermelését igen jelentékenyen növeli. Meglepő módon azonban úgy látszik, hogy ez az energiaforrásokból és aminosavakból álló kombinált tápanyag nem növeli a maximális csfraképes sejtpopuláció-sűrűséget. Ennek a jelenségnek az oka még nem teljesen érthető. Két valószínű magyarázat van a sejtszaporodás romlására, amikor a tenyészet exponenciális szaporodási fázisa csökkenő fázisra változik. Az ok vagy az, hogy egy vagy több tápanyag, amely szükséges a sejtek szaporodásához, bár nem szükséges a proteinszintézishez, kimerül, és a sejtszaporodás leáll; vagy egy vagy több citotoxikus metabolit, így iaktát vagy ammónia felhalmozódik a tenyészetben és gátolja a további sejtszaporodást. E két magyarázat közül az utóbbit részesítjük előnyben. Ezért — előítélet nélkül — úgy látszik, hogy a sejtszaporodást a citotoxikus metabolitok felhalmozódása okozza, és a tápanyag-adagolás folytatása — mint a találmány szerinti eljárásban — a tenyészet csírázóképességének meghosszabbítására szolgál, s így az összes termékhozamot növeli; a kiegészítő tápanyagok a csökkenő fázisban elsősorban a proteinszintézishez és mint energiaforrások használódnak fel, nem pedig mint a sejtszaporodást elősegítő anyagok. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy a fenti fejtegetés csak egy lehetséges magyarázata a jelenségnek amit megfigyeltünk, de a találmány oltalmi körét nem korlátozza. A találmány szerinti eljárás alkalmazható állati eredetű sejtek, például emlősökből származó sejtek tenyésztésére, általában beleértve azokat a sejteket, amelyek kívánt termékeket lényeges mennyiségben termelnek, így a Namalva sejteket és a Bowes melanoma sejteket. Az eljárást azonban előnyösen genetikailag módosított sejtvonalak tenyésztéséhez alkalmazzuk. így a sejtek lehetnek transzficiált állati eredetű sejtek, vagyis olyary állati eredetű sejtek, amelyeket heterológ génekkel transzficiáltunk, s így a sejteket tenyésztve, azok a megfelelő heterológ géntermékeket adják. Az ilyen transzficiált állati eredetű sejtek magukba foglalják a transzficiált emlős gazdasejteket, így a transzficiált kínai hörcsög ovarium (Chinese Hamster Ovary, CHO) sejtvonaiakat és elsősorban a heterológ génekkel transzficiált hibridoma és mieloma sejteket. Még előnyösebben a találmány szerinti eljárást olyan sejtvonalak tenyésztéséhez alkalmazzuk, amelyek monoklonális antitesteket termelnek, beleértve az Epstein Barr vírussal (EBV) transzformált, antitestet termelő sejtvonalakat és elsősorban a sejtfúziós technikával előállított hibridoma sejtvonalakat. A találmány szerinti eljárás alkalmazható bármely sejthez, amely szakaszosan tenyészthető, beleértve a rögzített sejteket, például a mikroenergiahordozós tenyészeteket és a burokkal rendelkező sejteket. Előnyösen azonban a sejtek szuszpenzióban tenyésztett sejtek. Bármely tennék, amely állati eredetű sejtek tenyésztésével előállítható, termelhető a találmány szerinti eljárás alkalmazásával. Tipikusan ilyen termékek a polipeptidek és proteintermékek, és a hormonok, így a növekedési hormonok, például a humán növekedési hormon (HGH), a íimfokinek, így az interferon, interleukinek, például az 1L2, rekornbináns antitest-molekulák és ezek fragmentumai, iparilag és terápiásán hasznos enzimek, így a tPA (szöveti plazminogén aktivátor) és az enzim-inhibiíorok, így a TIMP (Tissue Inhibitor of Metalloproíeinases). Kiváltképpen előnyös termékek a monoklonális antitestek. A táptalaj kiegészítését a kombinált tápanyaggal a tenyésztés alatt bármely megfelelő időpontban végezhetjük. A kiegészítő tápanyag adagolását elkezdhetjük a tenyésztés exponenciális szaporodási fázisa után, de előnyösen az exponenciális szaporoiási fázis alatt kezdjük el, elsősorban ennek máso- Jik felében. Előnyösen azonban a tenyészethez a tápanyagot hosszabb időtartamon át adagoljuk. A kiegészítő tápanyag adagolását befejezhetjük a tenyésztés exponenciális szaporodási fázisa alatt, de előnyösen tovább folytatjuk a stacioner szaporodási fázisban és még tovább folytathatjuk a tenyésztés csökkenő fázisában is, A jelen leírásban az „exponenciális szaporodási fázis” kifejezés a szaporodási periódust addig az időpontig jelenti, amelynél a csfraképes sejtpopuláció sűrűsége eléri a maximumot. Hibridoma sejtek tipikus szuszpenzió-tenyészetében például a kiegészítő tápanyag adagolását 25— 150 órával, előnyösen 40—60 órával és elsősorban körülbelül 50 órával a tenyésztés megindítása után kezdjük meg. így például a kiegészítő tápanyag adagolását megkezdhetjük, amikor a sejtszaporodás elérte a körülbelül 1X106 sejt/ml csíraképes sejtsűrűséget. Miután a csíraképes sejtek száma a tenyészetben csúcsértéket ért el, a kiegészítő tápanyag adagolását a tenyészethez tovább folytatjuk, legalább 5—20, előnyösen 10—15 órán keresztül. A kiegészítő tápanyag adagolását előnyösen 30—100 óra, a legelőnyösebben 40—60 óra, elsősorban körülbelül 40 óra teljes időtartamon át végezzük. Hasonló kiegészítő tápanyag-adagolási rendszer használható a hibridoma sejteknél általában és a transzficiált hibridoma és melanoma sejteknél is. Meg kell jegyeznünk, azonban, hogy a tápanyagadagolás időpontja és időtartama változtatható, tekintetbe véve a szóban forgó sejt szaporodási tulajdonságait. Hasonlóképpen változtathatók a kiegészítő tápanyagok komponensei is a tenyésztett speciális sejtnek megfelelően. így az energiaforrás a sejt részére bármely megfelelő energiaforrás lehet, de általában legalább egy szénhidrát energiaforrást, így cukrot, elsősorban glükózt tartalmaz. Más megfelelő szénhidrát energiaforrások a diszacbaridok, így a maltóz, laktóz és szacharóz, továbbá a monoszachari-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
