197042. lajstromszámú szabadalom • Eljárás állati eredetű sejtek tenyésztésére
5 197 042 dók, így a galaktóz, fruktóz stb. Más lehetséges energiaforrások a glicerátok, glícerinaldehid stb. A glutamin — azon kívül, hogy mint aminosav-prekurzor a proteinszintézisben szerepet játszik —, egy fő energiaforrása az állati eredetű sejtek tenyésztésének. Így a tápanyag energiaforrás komponense állhat gíutamlnból, rendszerint szénhidráttal, így glükózzal kombinálva. A kiegészítő tápanyag tartalmaz még egy vágytöbb amínosavat, amely tipikusan glutamin vagy ennek egy prekurzora, például glutaminsav. A kiegészítő tápanyag azonban, általában a rninew a vak kombinációját tartalmazza. A táp anyag tartalmazhat egy esszenciális aminosavat vagy néhány, vagy az összes esszenciális aminosav kombinációjából állhat. Ezek az amínosavak az arginin, ciszteín, cisztin, glutamin, glicin, hisztidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fcnil-aíanin, szerin, treonin, tripíofán, tirozin és vaiin. A tápanyag tartalmazhat továbbá egy alábbi nem esszenciális aminosavat vagy ezek közül néhánynak vagy az összesnek a kombinációjából állhat. Ezek a nem esszenciális aminosavak az aianin, aszparaginsav, aszparagin, glutaminsav és prolin. A tápanyag tartalmazhat még speciális aminosavakat is, így hidroxi-prolint, ykarboxiglutamátot és foszfoszerint. A kiegészítő tápanyag tartalmazhat még más tápanyagokat, így' kolint is. A tápanyag tartalmazhat továbbá szaporodást stimuláló és szabályozó faktorokat, így hormonokat is, bár ezek már általában a tenyésztés kezdetén jelen vannak a táptalajban. Meg kell jegyeznünk, hogy a tápanyag aminosavkomponensei tipikusan L-aminosavak, és jelen lehetnek sóik vagy prekurzoraik formájában is. Az egyes aminosavak helyett a tápanyag aminosav komponensei lehetnek dipeptidek és más rövid pepi id ek is. A tápanyagban alkalmazott energiaforrás és aminosav komponensek mennyisége kívánt esetben változtatható, ha meg akarjuk hosszabbítani a tenyészet csírázóképességét és biztosítani a termék szintéziséhez szükséges szubsztrátumot. A kiegészítő tápanyag komponenseit és ezek mennyiségeit azonban előnyösen a táptalaj analízise alapján választjuk meg. így a tápanyag tartalmazhatja a táptalaj azon komponenseit, amelyek a szaporodás során kimerültek, és ezeknek a tenyészethez adott komponenseknek a mennyisége előnyösen olyan, amely elegendő ahhoz, hogy a komponenseknek a tenyésztés kezdetén a táptalajban jelenlevő koncentrációszintjeit visszaállítsuk és fenntartsuk. A tápanyag tipikusan olyan, amely fenntartja azokat a táptalajkomponenseket, amelyek mint energiaszubsztrátumok vagy mint bioszintézis-prekurzorok a tenyésztés ideje alatt a feleslegben felhasználódtak. A tenyésztés kezdetén bármely megfelelő táptalaj használható. Egy kiváltképpen előnyös táptalaj a DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), rendszerint szérummal, például magzati borjúszérómmal (FCS) kiegészítve, bár a DMEM és más hasonló táptalajok módosításai a tenyésztési eljárd sok alapjaként használhatók. Célszerűen kevés szérumot tartalmazó táptalajok, szérummentes íápta-4 lajok és kevés proteint tartalmazó táptalajok használhatók. így a találmány egy előnyös kiviteli módja szerint eljárás állati eredetű sejtek tenyésztésére, a sejteket táptalajban tenyésztve, oly módon, hogy a tenyésztés alatt a táptalajt kiegészítjük egy kombinált tápanyaggal, amely a sejtek szaporodása során kimerült energiaforrásokat, aminosavakat és más tápanyagokat tartalmazza, és a tenyésztést folytatjuk a csökkenő fázisban is, így a sejtek termékeit állítjuk elő. A kiegészítő tápanyagot bármilyen módon a táptalajhoz adhatjuk. A tápanyagot a táptalajhoz adhatjuk egyetlen adagban vagy előnyösen több adagban, hosszabb időn keresztül. Ezek az adagok állhatnak különálló komponensekből, vagyis energiaforrásokból és aminosavakból vagy a komponensek bármely megfelelő kombinációjától. Előnyöseit azonban néhány vagy valamennyi komponenst hosszabb időtartamon ár folyamatosan adagolunk be. A tápanyag komponenseit a tenyészethez adhatjuk szilárd alakban, például porítva vagy szuszpenziók vagy előnyösen oldatok alakjában. Elsősorban az úgynevezett „oldhatatlan” aminosavakat, így a cisztint, tirozint és triptofánt — amelyek semleges pH-értéken csak kismértékben oldódnak — adjuk a táptalajhoz előnyösen egyetlen adagban, szuszpenzió formájában. Más, úgynevezett „oldható” aminosavakat előnyösen oldatok alakjában adunk a táptalajhoz. A legelőnyösebben azonban egy oldatot, amely energiaforrást, például glükózt és „oldható” aminosavakat, valamint adott esetben kolint is tartalmaz, hosszabb időtartamon át szívatással adunk a tenyészethez. A szívatásos adagolás a táptalajhoz végezhető azután, hogy bizonyos tápanyagkomponenseket, így a glutamint és az „oldhatatlan” aminosavakat egy adagban a táptalajhoz adtunk. A kiegészítő tápanyag pontos összetétele, ennek komponensei és mennyiségei a tenyésztendő sejt speciális típusától függnek. így például egy tipikus hibridoma sejttenyészetben a tápanyag fő komponensei a glutamin és a szénhidrát energiaforrás, így a glükóz. A glutamin összes beadagolt mennyisége általában 0,5—3, előnyösen 0,8—1,6, elsősorban 1—1,5 g/liter tenyészet. Ha energiaforrásként glükózt használunk, akkor az összes glükózbetáplálás rendszerint 1--10, előnyösen 3—6, elsősorban 4—5 g/iiter tenyészet. Más szénhidrát energiaforrások ekvivalens mennyisége ugyancsak használható a glutamin hasonló mennyiségeivel. Az aminosav-beíáplálás tipikus hibridomatenyészethez a glutamin mellett még a következő néhány vagy valamennyi aminosavat (beleértve sóikat és prekurzoraikat) tartalmazhatja: cisztin, tirozin, triptofán, iizin, hisztidin, arginin, glicin, vaiin, metionin, treonin, szerin, izoleucin, leucin és íenil-alanin. Az aminosavkomponensek általában 50—90%-át teszik ki annak az amlnosav-mennyiségnek, amely a tenyésztés megkezdésekor van jelen a táptalajban. Az egyes aminosavak (kivéve a glutamint) összes mennyisége a betáplált anyagban rendszerint 0—300, még inkább 20—200 ing/Üter tenyészet. A tápanyag előnyösen viszonylag nagyobb mennyisé6 5 10 15 20 25 30 35 <0 45 30 55 60 65
