197042. lajstromszámú szabadalom • Eljárás állati eredetű sejtek tenyésztésére
I 197042 A találmány tárgya eljárás állati eredetű sejtek, főképpen polipeptidet és proteint termelő állati eredetű sejtek tenyésztésére. Az utóbbi években figyelemre méltó és állandóan fokozódó érdeklődés nyilvánult meg a hasznos anyagokat termelő állati sejtek tenyésztése iránt. Az érdeklődés még növekedett a molekuláris biológia tíjabb eredményeivel, mert ezek lehetővé tették, hogy olyan, genetikailag módosított állati eredetű sejteket állítsanak elő, amelyek tenyésztve a kívánt polipeptid- vagy protein-anyagokat termelik. így a sejtfűziós eljárás -- amely Kohler és Miistein munkáján alapszik [Nature, 256, 496-597] — lehetővé teszi hibrid sejtvonalak, vagyis hibridomák előállítását, amelyek tenyésztve moncklonáüs antitesteket termelnek. A rekombináns DNS-technikákat szintén alkalmazták állati eredetű sejtekhez, heterológ génekkel transzformált sejtvonalak előállításához, amelyek tenyésztve a megfelelő géntermékeket adják. Számos esetben azt találták, hogy rekombináns termékek előállításához az állati eredetű gazdasejtek előnyösebbek, mint a mikrobiális gazdasejtek, példán! a baktérium- és élesztősejtek, főképpen akkor, ha a termékek komplex proteinek, amelyeket a teljes aktivitás eléréséhez gííkozilezésnek vagy más, utólagos transzlációs módosításnak kell alávetni. Az állati eredetű gazdasejtek környezete rokon a természetes sejíáilomány környezetével, amelyben a termékek képződnek. Abból a célból, hogy állati eredetű sejttenyészeteket alkalmazzanak kívánt termékek ipari előállításához, ki kell fejleszteni olyan tenyésztési eljárásokat, amelyekkel a termékek elegendő mennyiségben és kereskedelmileg elfogadható áron termelhetek. Mind ez ideig azonban a legtöbb ipari tenyésztéses eljárás mikrobiáíis tenyészetek fermentálásán alapult, és viszonylag keveset tudtunk azokról a faktorokról, amelyek állati eredetű sejtek Tenyészeteiben a termékhozamot befolyásolják. Ismeretes ;>é!dáui [WO 84/00777 szánni, nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentés] szekunder metabolitok, így antibiotikumok mikrobiáíis szakaszos tenyésztésű előállítása ügy, hogy a táptalajhoz folyamatosan hozzáadják azokat a tápanyagokat, amelyeket esszenciálisnak találtak a szekunder metabolitok termeléséhez; bár úgy látszik, hogy a szekunder metabolitok hosszan tartó termelése csak kissé javult. Hibridoma sejteket tenyésztettek DMEM táptalajban (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) raonoklonális antitestek előállítására [Sacks and Lennox: Vox Sang. 40, 99—104 (1981)]. Üjabban ismertettek egy eljárást emlősből származó, proteint vagy antitestet termelő sejt proteinvagy antitestíermelésének a fokozására [2153830A számú brit szabadalmi leírás], amely tartalmazza azt a műveletet, hogy a sejtet olyan hipertóniás táptalajban tenyésztik, amelynek ozmolariíása legalább körülbelül 340 milüozmól. A 2 153 830 A számú brit szabadalmi leírás ismerteti elsősorban burokkal rendelkező hibridoma sejtek tenyésztéséi, és azt, hogy a táptalajt feleslegben hozzáadott aminosavakkal teszik hipertóniássá. Saját kísérleteink állati eredetű, főképpen hibridoma sejítenyészetekke! azt mutatják, hogy az állati eredetű sejítenyészetből termelt proteinszinteket az ozmoiaritás mellett még más fontos faktorok határozzák meg. Tanulmányoztuk a sejtszaporodás és antitesttermelés kinetikáját hibridoma sejtek egyszerű szakaszos tenyészeteiben, magzati borjűszérummal (FCS) kiegészített DMEM táptalajban. Exponenciális szaporodási fázist követően a DMEM táptalajban a gluíamin körülbelül 2X10'' sejt/ml sejlpopulációs sűrűségnél kimerül, a sejtszaporodás leáll, a csfraképes sejtek száma a tenyészetben gyorsan csökken és az antiteslszintézis befejeződik. Ügy látszott, hogy a csíraképes sejtek számának a csökkenését a táptalajban levő esszenciális tápanyagok hiánya, elsősorban a glutamin hiánya okozza. Ismeretes, hogy táptalajban a glutamin nem stabil, és hogy bomlástermékei közül némelyek sejtmérgek, így elsősorban az ammónia és a pirrolidon-karbonsav. Ezért a tápanyaggal adalékolt szakaszos tenyészet egy egyszerű formáját vizsgáltuk, ahol a táptalajhoz a tenyésztés késői exponenciális fázisa alatt és ezt követően glulamint adagoltunk. A glutamin egyetlen adagban való hozzáadása a tenyészethez a késői exponenciális fázisban nem befolyásolta lényegesen a sejtpopuláció sűrűségének a maximumát, de a tenyészet hosszabb ideig csfraképes maradt, s emellett az összes antitesttiter emelkedett. A kísérletet úgy is elvégeztük, hogy az egyetlen adag helyett ismételt glutamindózisokat adtunk a táptalajhoz. A gíutamindózisok ismétlése (az összes koncentráció a végén ugyanaz mint az előző egyetlen adagolásnál) 40 órás' perióduson keresztül nem idézett elő javulást a sejt- vagy antitesttermelésben, összehasonlítva az egyetlen adag glutamint kapott tenyészetekkel. Ezek az eredmények nem voltak várhatók. A glutamin, bár kimerült a táptalajból, úgy látszik, nem az egyetlen faktor, amely korlátozza a populáció sűrűségéi, mivel a glutamin hozzáadása a tenyészethez nem növelte a csíraképes sejtek sűrűségének a maximumát. Inkább úgy látszik, hogy a glutamin adagolása meghosszabbítja a tenyészet csírázóképességét, aminek eredménye a teljes antitest-kitermelés csekély növekedése. Tanulmányoztuk továbbá a faktorokat, amelyek befolyásolják az állati eredetű sej «enyészetekből termelt proteinszintet. Nem várt módon azt találtuk, hogy a glutamin és más tápanyagok beadagolása — kiváltképpen ha kis sebességgel és hosszabb időn keresztül történik — tenyésztett hibridoma sejtvonalak antitesthozamát jelentősen növeli, elsősorban a szakaszos tenyésztés csökkenő fázisában. Hasonló eredményekre jutottunk transzformáit állati eredetű sejtek tenyészeteiből heterológ géntermékek előállításánál is. A találmány tárgya eljárás állati eredetű sejtek szakaszos tenyésztésére, a sejteket táptalajban tenyésztve, oly módon, hogy a tenyésztés alatt a táptalajt egy vagy több energiaforrásból és egy vagy több aminosavból álló kombinált tápanyaggal kiegészítjük, és a tenyésztést a terméket (termékeket) termelő sejtek tenyésztésének csökkenő fázisában is folytatjuk, s így sejtte miéke két állítunk elő. A találmány alapját az az új felismerés képezi, ? 3 10 15 70 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
