196915. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés oldatban lévő egy vagy több komponens elkülönítésére kromatográfiás úton
13 196 915 14 4. táblázat folytatás Frakció száma Vakpróba Percenkénti számlálás (cpm) Összesen 9 79,0 49,6 10 98,0 67,7 11 134,0 102,9 12 182,0 152,5 13 414,0 389,3 14 485,0 464,4 15 766,0 757,5 16 854,0 834,7 17 635,0 615,5 18 450,0 424,6 19 504,0 486,4 20 378,0 348,5 21 284,0 256,8 22 158,0 127,7 23 131,0 99,8 5169 cpm Összesen 20534,0 20549,4 17294 A fentiekből kitűnik, hogy a kitermelés körülbelül 85%-os. Ha ezt az elválasztást hagyományos kromatográfiával végezzük, akkor sokkal több elitemre van szükség és az elválasztás több időt vesz igénybe. 4. példa Ebben a kísérletben egy színezék-keveréket választottunk szét dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfiával. A keverék összetétele: 35% Ceres red 7B, 28% Nitro fast blue 2B, 25% Nitro fast violet FBL és 127o Ceres yellow R (valamennyi térfogatszázalékban). Ez a színezék-keverék Merck gyártmány (katalógus száma 9354). A színezék-keverék 30 pl diklór-metános oldatát dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfiás berendezésbe injektáljuk, amelynek adszorbense Lichroprep Si-60 (Merck gyártmány, katalógus száma 9336), egy szilikagél alapú adszorbens, a szilikagél szemcsenagysága 15—20 pm. Az oszlop méretei: hossza 10,6 cm és belső átmérője 10 mm. Az áramlás sebessége 2 ml/perc, az eluens diklór-meíán. A szétválasztás eredményeit a 10. ábra szemlélteti grafikusan. A grafikon a frakciók 254 nm-en mért optikai sűrűségét (O. D. ■= optical density) adja meg. 5. példa Ebben a kísérletben policiklusos aromás vegyületek keverékét választottuk szét dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfiával. A keverék: 50% benzol, 30% naftalin és 20% antracén (térfogatszázalékok) n-heptánban oldva. 50 pl mintát injektáltunk, a 4. példa szerinti méretű oszlopot és ugyanazt az adszorbenst használva. Az áramlás sebessége 2 ml/perc, minden egyes frakció térfogata 1 ml. Az eluens n-heptán. A szétválasztás eredményeit all. ábra szemlélteti grafikusan. A grafikon a frakciók 254 nm-en mért optikai sűrűségét adja meg. Amint az a grafikonból látható, a komponensek szétválasztása három éles csúcsot ad. 6. példa Ebben a kísérletben alkil-flalátok keverékét választottuk szét dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfiával, a 4. példa szerinti oszlopot és adszorbenst használva. Az alkil-ftalát-keverék dibutil-ftalátot, dietil-ftalátot és dimetil-ftalátot tartalmazott n-heptán és etil-acetát 90:10 térfogatarányú keverékében. Az eluens n-heptán és etil-acetát 90:10 térfogatarányú keveréke. Az áramlási sebesség 3 ml/perc, a frakciók térfogata 1 — 1 ml. A szétválasztás eredményét a 12. ábra szemlélteti grafikusan, a grafikon a frakciók 254 nm-en mért optikai sűrűségét adja meg. Amint az a grafikonból látható, éles elválasztást kaptunk. 7. példa Anti-hCG tisztítása Az anti-hCG tisztítását dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfiával végeztük, két különböző forrásból származó vcgyiiletet használva: a) a SERONO cég gyártmányát és b) a MILES cég gyártmányát, melyek közül az utóbbi, mint ismeretes, kevésbé koncentrált, mint az előbbi. a) SERONO-féle anti-hCG tisztítása Egy fiola anti-hCG-t feloldunk 1 ml foszfát-pufferban (pH = 6,3). Az oldatot 10,6 cm hosszú és 10 mm belső átmérőjű oszlopra visszük, amely adszorbensként 3 g Whatman-féle DEAE DE-52 cellulózt (védjegyzett termék) tartalmaz. Az oszlopot 6,3 pH-értékű foszfát-puffcrral eluáljuk 2,5 ml/ perc áramlási sebesség mellett. Már az első frakciókban (4—8.) igen nagy protein-csúcsot kapunk. Az oszlopot a közvetlen kimutatás céljából mérőcellával és regisztráló berendezéssel kötjük össze. A puffer pll-értékét 7,1-re változtatva, ez csaknem azonnal proteinek megjelenését idézte elő. Az cluálás még két nagy protein-csúcsot eredményezett. A meghatározást úgy végeztük, hogy minden egyes frakció optikai sűrűségét (O.D.) mértük, az abszorpciót 280 nm-en leolvasva. Az immunológiai aktivitást a hCG-tartalmú frakciók meghatározásával R1A (radio-immuno-assay) módszerrel végeztük, a következő oldatokat használva: 100 pl ,25J- hCG, 100 pl hCG-mentes szérum és az egyes frakciók 100 pl-e. Az inkubálást 3 órán át szobahőmérsékleten végeztük. A szétválasztást polietilénglikol/kétszeres antitest (20/1 térfogatrész) összetétellel végeztük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
