196847. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás 1,2-dihidro-szteroidok előállítására
1 2 vizsgáltuk. A 2 837 464. számú USA-beli szabadalmi leírásban szereplő Arthrobacter simplex (ATCC száma 6946) mikroorganizmust gyakrabban használják szteroidok 1 -dehidrogénezésére. Ezért a leírás legnagyobb részében ezt a mikroorganizmust használjuk a találmány szerinti eljárás ismertetésére. De felhívjuk a figyelmet, hogy bármely 1-dehidrogénező mikroorganizmus alkalmas a találmány szerinti eprás végrehajtására. A mikroorganizmusokat a következő összetételű táptalajon tenyésztettük: a) szervetlen vegyületek (nitrátok vagy ammónium-sók) vagy szerves nitrogéntartalmú vegyületek (élesztő extraktum, pepton, gabonaáztatólé) a növekedéshez szükséges nitrogén biztosítására, b) szén- és energiaforrások, például szénhidrátok és cukorszármazékok, olaj, zsírsavak és metil-észtereik, alkoholok, aminosavak vagy szerves savak, c) ionok és nyomelemek (nátrium, kálium, magnézium, foszfát, szulfát, manganát, réz, kobalt, inolibdén) olyan mennyiségben, amely a csapvízben vagy a kevésbé finomított közegként használatos anyagokban található. A mikroorganizmusok növekedésükhöz oxigént igényelnek a felettük lévő légtérben. Az A. simplex növekedéséhez megfelelő hőmérséklet 10—45 °C, előnyösen 28—37 °C. A növekedéshez optimális pH-érték semleges körül van. A sejteket szteroid-1-dehidrogénezésére úgy aktiváljuk, hogy l,2-telített-3-keto-szteroidot, például androszta-4-én-3,17-diont vagy kortizon-acetát adunk 0,005 tömeg/térfogat%, vagy nagyobb mennyiségben a közeghez. Az indukálószer jelenlétében a sejteket 6 órán keresztül inkubáljuk, majd összegyűjtjük és szárítjuk őket. Az indukálószer a növekedési ciklus bármely pontján hozzáadható a mikroorganizmusokhoz. A disznózsír-olajhoz (triglicerideket és szabad zsírsavat tartalmazó olaj) hasonló táptalajon tenyésztett kultúrák a szteroid-1 dehidrogcnázt gyorsan kezdik szintetizálni, míg a glükózon tenyésztett mikroorganizmusok csak a szubsztrátum elfogyasztása után kezdenek enzimet termelni. Az inkubálást 6 vagy még több órán keresztül folytatjuk az indukálószer hozzáadása után, majd a sejteket begyűjtjük az oldószeres folyamatban való használat vagy szárítás céljából. A sejteket szárítás céljából elkülönítjük a táptalajtól, és hagyományos módszerek, például centrifugálás, flokkuáltatás, szűrés vagy ultraszűrés segítségével koncentráljuk őket. Az elválasztott sejteket ezután csökkentett nyomáson 1-85 °C, előnyösen 55-75 °C hőmérsékleten meleg levegővel porlasztva, vagy forgatva szárítjuk, amíg az anyag nedvességtartalma 1-10%, előnyösen 5% nem lesz. A biokonverzióhoz használt sejteket 5 °C-on tároljuk. Aktív szárított sejteket standard módszerek segítségével állíthatunk elő a szárított sejtek immobilizálásával például úgy, hogy poliakril-amid gélbe zárjuk vagy egy polielektrolit hordozóanyaghoz kollagén vagy kovalens kötéssel kötjük őket (Methods in Emzimology, XL1V. kötet, Academic Press ine., New York, 11-317. oldal /1976/). A biokonverziót az elkészített sejtek és a szteroid szubsztrát egymásra hatása révén étjük el. Általában a sejteket és a szteroidot egy gyengén pufferolt 6-10, előnyösen 7,25-8,5 pH-jú vizes közegben szuszpendáljuk. A sejtkoncentráció 0,1 -50 g/1, a szteroid és a sejtek tömegaránya 0,05-5. Vizes közegben 8-10 g/1 sejt-, illetve 5—10 g/1 szteroidkoncentráció előnyös a biokonverzió végrehajtásához. Katalitikus mennyiségű exogén elektron átvivő anyagot (például 5 x 10"4 mól menadiont) is adunk a reakcióelegyhez. Katalizátorként menadion (2-metil-l ,4-naftokinon), fenazin-metoszulfátot, diklór-fenil-indofenolt, 1,4-naftokinont, menadion-biszulfitot, ubikinonokat (Koenzim QJ és K-vitamin típusú vegyületeket használhatunk. Az elegyeket 0—14 napon keresztül 5-45 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubálás alatt az elegyben felesleges mennyiségű molekuláris oxigénnek kell lennie, ezért előnyösen keveijük. Az 1-dehidrogénezés sebessége általában az idővel csökken. A biokonverzió 10 g/1 szubsztrát alkalmazásával kevesebb, mint 24 óra alatt 98-100%-os lehet. Az eljárást a következő módokon hajthatjuk végre: a) A szteroidot és a menadiont gyengén pufferolt vizes oldatban szuszpendáljuk, majd a szárított sejteket hozzáadjuk. A Tween 80-hoz hasonló felületaktív anyagok is hozzáadhatok az elegyhez0-5% koncentrációban. b) A sejteket vizes pufferoldatban szuszpendáljuk, majd a metanolban, etanolban.acetonbari (amely térfogata nem lehet több, mint a végtérfogat 5%-a) oldott elektron átvivő anyagot adjuk hozzá. A szteroid szubsztrátot száraz porként vagy vízzel elegyedő szerves oldószerben (például dimetil-formamidban, etanolban, metanolban, acetonban, dimetil-szulfoxid ban) vagy vízzel nem elegyedő szerves oldószerben (például toluolban) oldva vagy szuszpendálva adjuk hozzá. c) A száraz sejteket kis mennyiségű pufferben rehidratáljuk további puffer vagy szerves oldószer hozzáadásával. A végleges 0-95% (tf/tf) eléréshez etanolt, acetont, xilolt, butil-acetátot, metilén-kloridot vagy toluolt adunk hozzá. A használt aromás szénhidrogén mennyisége a legjobban oldódó szteroid feloldásához szükséges oldószer felétől a legkevésbé oldódó szteroid feloldásához szükséges oldószer felétől a legkevésbé oldódó szteroid oldásához szükséges oldószer négyszerese között változhat. A reakció megindításához elektron átvivő anyagot és szteroidot adunk a reakcióelegyhez. Az aromás szénhidrogént előnyösen a szteroiddal együtt adjuk az elegyhez, bár ez egy korábbi vagy későbbi időpontban is megtörténhet. d) A nedves sejttömeget szuszpendáljuk vagy a fermentációs levet hígítjuk gyengén pufferolt vizes oldattal, majd egy exogén elektron átvivő anyagot, a szteroidot és egy aromás szénhidrogént adunk hozzá. A találmány szerinti reakcióban használható vegyületek a 3-keto-A4-androsztén és a 3-keto-A4-pregnén típusú szteroidokhoz tartoznak. A szteroid-1 -dehidrogenáz szubsztrátjai az A gyűrű 1-es és 2-es szénatomja között telítettek, és az A gyűrű 3-as helyzetében hidroxil- vagy ketocsoportot tartalmaznak. Az androsztén-típusú vegyületek közé az alábbiak tartoznak: 1) androszta-4-én-3,17-dion, 2) androszta-4,9(l l)-dién-3,17-dion és ezek 6-alfa-fluor-, 6-alfa-metiI- vagy 16 metil-származékai, 3) 1 l-béta-hidroxi-androszta-4-én-3,17-dion és származékai. A felhasználható r-keto-A4-pregnén-típusú vegyületek közé az alábbiak tartoznak: 196.847 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
