196847. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás 1,2-dihidro-szteroidok előállítására
2 1 1) 17-alfa-hidroxi-pregn-4-én-20-in-3-on és 16-metil-származékai, 2) 1 l-béta,21-dihidroxi-pregn-4,l7(20)-dién-3-on és 6-alfa-metil-származékai, 3) 2-klór-pregn-4,9(l l),17(20>trién-21-al-3-on, 4) a 3,20-diketo-A4-pregnének számos csoportja, vagyis a) 11,17,21-trihidroxi-vegyületek, mint például a hidrokortizon és 6-alfa-metil-származéka, b) 9-béta,l 1 -béta-epoxi-17,21 -vegyületek, mint például a 9-béta,ll-béta-epoxi-17,2l-dihidroxi-16-béta-metil-pregn-4-én-3,20-dion, c) 2^0-diketo-4,9(ll)-pregnén-diének, mint például a 17 -alfa ,21 -dihidroxi-pregn-4,9( 11 )-dién-3,20- -dion és ennek 16-alfa-metil-, 16-béta-metil- vagy 16-alfa-hidroxi-származékai vagy 17-alfa-acetát-észtere, d) 3,20-diketo-4,9(l 1)-, 4,9(11),16-pregnén-triének, mint például a 21 hidroxi-pregn-4,9(l 1 ),16-trién-3,20-dion és ennek 6-alfa-fluor-származéka. A 21-es helyzetben hidroxil-csoportot tartalmazó 2 és 4 pont alatti szteroidok 21-észter származékai szintén alkalmazhatók szubsztrátként. Az előnyös 21-észterek az alacsonyabb szénatomszámú zsírsavakhoz hasonló alacsonyabb szénatomászámú alkilvagy aril-csoportokat tartalmaznak, például ecetsavat vagy monoriklikus karbonsavakat, például benzoésavat. A biokonverzió terméke és az át nem alakult szubsztrát szokványos módszerekkel választható el a keverékből. A szteroidokat általában szűréssel, majd a szűrőn maradt lepény szerves oldószenei, mint például acetonnal vagy metilén-kloriddal való extrakciójával választják el. Egy másik alternativ módszer az, hogy az egész biokonverziós keveréket egy vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, mint például butil-acetáttal vagy metilén-kloriddal extraháljuk, majd a terméket a szerves oldószerből különítik el. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal illüsztráljuk, anélkül azonban, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk. A példák is bizonyítják, hogy a találmány szerinti eljárás sokkal jobb az irodalomból ismert eljárásoknál. A biokonverziót a fentiekben részletezett körülmények között hajtottuk végre. 1. példa Szárított sejtek előállítása 6-6 g/1 keményítőcukrot, peptont és kukoricalekvárt tartalmazó (pH = 7,0) rázó lombikba Bacterium cycloocvdans-t (ATCC 12673) oltottunk. A kultúrákat 28 6C hőmérsékleten egy rotarázógépen inkubáltuk, amíg glükóz kimerülés nem lépett fel. Ekkor 0,5 g/1 kortizon-acetátot adtunk hozzá, és a lombikot további 16 órán keresztül inkubáltuk. A sejteket centrifugálással nyertük ki, kétszer vízzel mostuk, majd csökkentett nyomáson 45 °C hőmérsékleten megszárítottuk. Androszta-1,4-9(1 l)-trién-3,17-dion előállítása 6-6 g/1 glükózt, kukoricalekvárt és porlasztva szárított zsíremulziót tartalmazó rázólombikokban Arthrobacter szimplex (ATCC 6946) mikroorganizmust tenyésztettünk. A kultúrákat 28 °C hőmérsékleten rotációs rázóban addig inkubáltuk, amíg glükóz kimerülést nem észleltünk. Ekkor korizon-acetátot (0,15 g/I) adtunk az elegyhez, hogy megindítsuk a szteroid-1-dehldrogenáz szintézist. Egy éjszakai inkubálás után a sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze. A sejt pelleteket 55 °C hőmérsékleten alacsony nyomáson 24 órán át szárítottuk. 24 órával később a száraz anyagot egy légmentesen záródó tartályba tettük és 5 °C hőmérsékleten tároltuk, amíg a biokonverzióhoz fel nem használtuk. 2. példa (1) Egy edénybe a következő anyagokat mértük be (1 1 alap): a) 0,9 1 50 mmól-os kálium-foszfát puffer (pH*7,5) b) 3,66 g száraz A. simplex sejt c) 0,08 g menadion d) 8 g 21-acetoxi-pren-4,9(ll),16-trién-3,20-dlon e) 100 ml toluol (2) Keverés közben 62,8 J/l.min hőfelvételi sebességgel melegítettük. (3) Annyi levegőt eresztettünk a lombikba, hogy a gáztérben lévő oxigén mennyisége 3-6% legyen. (4) A hőmérsékletet 28±1 °C-on tartottuk. (5) 25 órás reakcióidő után a toluolos fázist elválasztottuk. Ebben az esetben a toluolos fázis összetétele a következő volt: 94,3% acetoxi-pregn-1,4,9(11 ),16)-tetraén-3,20-dion, 4,2% 21-hidroxi-pregn-l ,4,9(11),16-tetraén-3,20-dion 1,5% 21-acetoxi-pregn-4,9(l 1),16-t rién-3,20-dion. A fenti lépések a következő eltérésekkel hajthatók végre: (1) lépés a) A puffer pH-ja 6-10 között változhat. b) Az A. simplex mennyisége akkorára korlátozható, amely éppen elegendő a reakció befejezéséhez. Általában 0,05-1 g sejt/1 szteroid mennyiségben alkalmazzuk. Az enzim mikrobiális forrása: Arthrobacter (Corynebacterium) szimplex (ATCC 6946) vagy Bacterium cyclooxydans (ATCC 12673). A mikroorganizmus előállítása: Az A. simplex sejtteket a fermentlében használhatjuk, vagy össze gyűlhetjük, megszáríthatjuk, acetonos kezelést alkalmazhatunk vagy immobilizálhatjuk őket a szakirodalomból ismert módszerek segítségével. c) Elektronakceptorként a következő vegyületeket alkalmazhatjuk: menadion (2-metil-l ,4-naftokinon), menadion-biszulfit, 1,4-naftokinon és más K-vitamin típusú vegyületek. Az elektronakceptor alkalmazott mennyisége a költségektől és a reakciósebeséggel kapcsolatos megfontolásoktól függ. A reakciósebesség lineárisan arányos a menadion koncentrációval. Általában 5-40 g elektron akceptor/kg szteroid felhasználása előnyös. d) A szteroid koncentráció olyan magas legyen, amennyi hatékonyan át tud alakulni. A szteroid a 3-keto-A4-androsztének vagy a 3-keto-A4-pregnének közé tartozzon, és a szerves oldószerben oldhatósága nagyobb legyen, mint 5 g/1.. e) Az aromás szénhidrogén toluol, benzol vagy xilol lehet. Ezeket az oldószereket együttesen, vagy más, vízzel nem elegyedő oldószerrel, például hetánnal vagy metilén-kloriddal hígítva alkalmazhatjuk. Az aromás szénhidrogén mennyisége a legjobban oldódó kiindulási vagy végtermék szteroid feoldásá-196.847 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A
