196847. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás 1,2-dihidro-szteroidok előállítására
1 2 A találmány tárgya mikrobiológiai eljárás 1,2-dehidro-szteroidok előállítására a megfelelő 1,2-telített származékaikból. A kortikoszteroidokat először az ötvenes években használták gyógyászati célokra, amikoris a kortizon-acetátot reumás arthritis kezelésére alkalmazták. A későbbi vizsgálatok bebizonyították, hogy az 1,2- -helyzetben telítetlen hidrokortizon, illetve kortizon származékok, a prednizolon és prednizon, jelentős többlethatással rendelkeznek, és kevesebb só visszatartást okoznak. Ezt követően a legtöbb szteroidot, amelyet a kortikoidok okozta betegségek kezelésére alkalmaztak, úgy állították elő, hogy az 1- és 2-helyzetben kettős kötést tartalmazzanak. 1977-ben két amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás a kortikoszteroidok szintézisére szterin prekurzorokból kiinduló eljárást javasolt, amely a kortikoszteroidok szintézisének új megközelítését jelentette. A 4 035 236. számú USA-beli szabadalmi leírás 9alfa-hidroxi-androszténdion előállítására vonatkozik szitoszterin, sztigmasztcrin vagy koleszterin fermentálásával. A 4 041 055. számú USA-beli szabadalmi leírás gyógyászatiig alkalmas kortikoszteroidok ebből az androsztén-származékból való általános szintézisére vonatkozik. Az ebben a folyamatban leírt intermedierek 3-keto-A^- (11 konligurációjúak lehetnek. További, az 1,2-telített szteroidok 1,2-dehidro-sztcroidokká való átalakításával foglalkozó irodaimi hivatkozások az alábbiak: A 2 837 464. számú USA-beli szabadalmi leírás Corynebacteriumnial történő dién-előállítást ír le. A leírás szerint a szteroidok 1-dehidrogenézését fermentációs úton, Arthrobacter (Corynebacterium) simplex segítségével hajtják végre. A 3 360 439. számú USA-beli szabadalmi leírás 1-dehidro-szteroidok előállítására vonatkozik. A szteroidok 1 -dehidrogénczését úgy végzik el, hogy A. simplex sejteket rövidszénláncú alkanoJlal vagy alkanonnal, például acctonnal előkezelnek, majd szubsztrátummal és egy hidrogén átvivő katalizátorral összekeverik. Charney, W. és Herzog, H.: Microbial Transformation of Steroids (Academic Press, Inc., New York, 4-9. és 236-261. oldalak /1967/) című könyvében a szteroid biokonverziókról ad történeti áttekintést, és felsorolja az 1-dehidrogénezéshez ismert és használatos mikroogranizmusokat. Yamane, T., Nakatani, H. és munkatársai (Biotechnology and Bioengineering, 21, 2133 /1966/) 4-androsztén-3,17-dion Nocardia rhodocrous mikroorganizmussal történő 1 -dehidrogénezésének vizsgálatát végezték el 50% benzol-heptán tartalmú elegyben. Ennek az oldószernek a biokonverziós elegyhez való hozzáadása következtében a reakciósebesség 180-szeresére növekedett. A benzol azonban rákkeltő tulajdonságú. A Nocardia rhodocrous aktivitása szempontjából az előnyös elektron-akceptor a fenazin-metoszulfát volt. Ez az elektron akceptor túl drága és instabil ahhoz, hogy a biokonverziós folyamatokban használni lehessen. A Nocardia rhodocrous enzim inaktív volt menadion, (2-metil-l ,4-naftokinon), az Arthrobacter simplex baktérium szempontjából kedvező elektron akceptor jelenlétében. A Nocardia rhódocrousban lévő enzim különbözik az A simplex által termelt enzimtől. A reakció 20% szteroid tartalmú szerves oldószerben játszódott le. Kimutatták, hogy a szteroid növekvő koncentrációjával a reakciósebesség csökkent. Az oxigén az 1-dehidrogénezési reakció nélkülözhetetlen eleme. Az alkalmazott oldószer (50% benzol-heptán) oxigén jelenlétében gyúlékony. Azt, hogy az oxigént hogy vezették be a rendszerbe úgy, hogy a gyulladást elkerüljék, nem ismertették. Somoto, K., Jin, I. és munkatársai (Agricultural Biological Chemistry, 44, 1119-1126 /1980/) a hidrokortizon A simplex-szel való 1 -dehidrogénezését vizsgálták. Két egymással nem elegyedő oldószert, n-butanolt és n-amil-alkoholt használtak, de a biokonverzió nem játszódott le ezeknek az oldószereknek a jelenlétében. Vízoldható olószereket, például 10% metanol-víz és 10% propilén-glikol-víz, találtak oldószerként a legmegfelelőbbnek. összefoglalóan megállapítható, hogy az ismert irodalmi hivatkozások nem ismertetnek vagy javasolnak találmányunk szerinti javított eljárásokat. A találmány szerinti eljárás során az Arthrobacter simplex vagy Bacterium cycloxydans mikroorganizmus sejtek vizes sűrű szuszpenziójához aromás szénhidrogénekből álló, vízzel nem elegyedő oldószert, exogén elektron akceptort és dehidrogériezendő szteroidot adunk. A szuszpenziót keverjük, és az oxigénbevezetést úgy tesszük lehetővé, hogy a gáztérben az oxigéntartalmat kisebb értéken tartjuk, mint a robbanáshoz szükséges oxigén mennyisége, vagy a reakciót a szerves oldószer gyulladáspontja alatti hőméisékleten hajtjuk végre. A találmányunk szerinti eljárás előnyei az ismert mikrobiológiai szteroid-dehidrogénezési eljárásokkal szemben: a) a biokonverzió végtermékében kevesebb az átalakulatlan szteroid, b) a reakció nagyobb szteroid koncentráció alkalmazásával hajtható végre, c) fajlagosan kevesebb mikroorganizmus sejt, például A. simplex szükséges a szteroid konverziójához, d) az eljárás a szteroidban, a mikroorganizmus sejtjeiben vagy sejtek által a szteroidból végzett szennyeződésekkel szemben kevésbé érzékeny, e) a redukció vagy a mikroorganizmus sejtekben jelenlévő szteroid degradáló enzimek teljes eltávolítása nagyobb kitermeléssel valósítható meg. A találmányunk szerinti oldószeres eljárás azért is előnyösebb a más, például Nocardia rhodocrous mikroorganizmussal végzett eljárással szeben, mert az A. simplex katalizálta reakció stabilabb és olcsóbb elektron akceptorok, pélául a menadion jelenlétében hajtható végre. A találmány szerinti eljáráshoz bármely ismert 1- -dehidrogénező mikroorganizmus felhasználható. Az 1-dehidrogénező baktériumokat Bergey: Manual of Determinative Biology (8. kiadás) szerint két csoportra oszthatjuk. Az általunk leírt eljárás sikeresen alkalmazható az Arthrobacter és Corynebacterium fajokra, és azokra a törzsekre, amelyeket a 17. rész Actinomycetes és hasonló mikroorgranizmusok címszó alatt tárgyal. Más törzsek 1 -dehidrogénező fajai, mint a Nocardia, Mycobacterium, Streptomyces és Bacterium is alkalmasak az eljárás megvalósítására. Eljárásunkat két, mindenki által hozzáférhető szteroidokat 1-dehidrogénező hatású mikroorganizmuson mutatjuk be. Egyrészt a 3 065 146. számú USA-beli szabadalmi leírásban 1-dehidrogénezőként szereplő Bacterium cyclooxydans-t (ATCC száma 12673) 196.847 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
