196843. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-lizin előállítására
1 2 get mutat, restrikció-génhiányos mutációval rendelkező transzkonjugánsnak tekintünk. (2) Vorynebacterium DDPS génjének (dapA) klónozása: A klónozott Escherichia coli gazdaszervezet-vektor rendszerrel hajtjuk végre. A vektorként használt pBR322 a Takara Shuzo Co., Japán által gyártott kereskedelmileg beszerezhető termék. Donor DNS-ként használt kromoszóma DNS-t Corynebacterium glutamicum ATCC 13032-ből izolálunk a jelen találmány feltalálói által korábban már közölt eljárás szerint (126789/83 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés. 1. példa (1) cikkelye). A Sai l restrikciós enzimhez készített 120 m1 reakcióoldathoz (10 mmól TRIS-HC1, 7 mmól magnézium-klorid, 100 mmól nátrium-klorid, pH 7,5), amely 4 jug pBR322 DNS-t és 8 jug Corynebacterium glutamicum kromoszóma DNS-t tartalmaz, hozzáadunk 12 egyég Sál I-et (Takara Shuzo Co., Japán termék). Az elegyet 37 °C-on 60 percig reagdltatjuk, majd a reakciót 65 °C-on 10 percig tartó melegítéssel félbeszakítjuk. A reakcióval emésztett termékhez 30 Ml T4 ligáz pufferoldatot (660 mmól TR1S . HCl), 30 Ml 5 mmólos ATP-oldatot, 0,3 egység T4 ligázt (a Takara Shuzo Co„ Jajrán terméke) és 120 pl vizet adunk. Az elegyet 12 C-on 16 óra hosszat reagáltatjuk. A ligáz reakcióelegyet használjuk az Escherichia coli K 12 TM103 altörzs transzformációjához. Alkalmas TM103 sejteket Dagert és munkatársai módszere szerint (Dagert, M. et al.: Gene 6,23 /1979/) preparálunk. Azaz TM103 törzset inokulálunk 50 ml L táptalajba, amelyhez 50 Mg/ml diamino-pimelinsavat adtunk, és addig tenyésztünk 37 °C-on, amíg a 550 nmnél Tokyo Kodén kloriméterrel mért abszorpció (OD) eléri a 0,5 értéket. A tenyészfolyadékot 10 percig hűtjük, és 20 ml lehűtött 0,1 mólos kalcium-klorid oldatban szuszpendáljuk. A szuszpenziót 20 percig 0 °C-on tartjuk. A sejeteket centrifugálással összegyűjtjük, és újból szuszpendáljuk 0,5 ml 0,1 mólos kalcium-klorid oldatban. A szuszpenziót 18 óra hoszszat 0 °C-on hagyjuk állni. A szuszpenzió 400 Ml-éhez hozzáadunk 200 pl előbb elkészített ligáz reakcióelegyet, és az elegyet 10 percig 0 °C-on tartjuk, majd 5 percig 37 °C-on melegítjük. Utána hozzáadunk 9 ml L táptalajt, amely 50 jug/ml diamino-pimelinsavat tattalmaz, és az elegyet 37 °C-on 2 óra hosszat rázatva inkubáljuk. A tenyésztett sejteket kétszer mossuk centrifugálva fiziológiás sóoldattal, és 50 pg/ml ampicillint tartalmazó M9 minimál agartáptalaj lemezen széiesztjük, és 37 °C-on 4 napig tenyésztjük. Az így kapott ampicillin-rezisztenciáva! rendelkező és diamino-pimelinsavat nem igénylő transzformált sejteket 50 Mg/ml ampicillint tartalmazó L agarlemezen (1,5% agart tartalmazó L táptalaj) egysejt-telep izolálásnak vetjük alá. A tisztított transzformált mutánsok tenyésztett sejtjeiből a plazmid DNS-t An és munkatársainak módszere szerint izoláljuk (An,G. et al.: J. Bacterial., 140, 400 /1979/). A plazmid DNS-t restrikciós enzimekkel emésztjük, és agarózgél-elektroforézissel analizáljuk. Azt találjuk, hogy a plazmid DNS-nek olyan szerkezete van, hogy a 4,2 Kb-os Sal I DNS-fragmens a pBR322 egyetlen Sal I hasítási helyére illeszkedik jc. A plazmidot pCDl-nek nevezzük. A pCDl-et használjuk az AT998 DDPS-génhiányos mutáns törzs és az AT997 THPS-génhiányos mutáns törzs transzformációjához, amelyek Escherichia coli K 12 altörzsei. Az AZ998 törzs és az AT997 törzs (Escherichia coli K 12 AT997, FERM BP-719) transzformációját a TM103 törzs transzformációjához hasonló módon hajtjuk végre. Az ebből a két részből - kapott, ampicillinrezisztenciával rendelkező transzformált mutánsok egyike sem igényel diamino-pimelinsavat. Ezekből a tényekből nyilvánvaló, hogy nemcsak DDPS gén (dapA), hanem a Corynebacterium glutamicum THPS génje (dapC) is jelen van a pCDl-en klónozott 4,2 Kb-os Sal 1 DNS-fragmens. A gazdaszervezetben, a klónozási lépésben használt TM103 törzsben meglévő restrikció-génhiányos mutációt főként a klónozás szaporaságának fokozására hasznosítottuk, és ilyen mutációval nem rendelkező törzsek is használhatók gazdaszervezet-mikroorganizmusként. (3) A pAC2 plazmid előállítása: Corynebacterium glutamicim-ból származó dapA és dapC géneket tartalmazó 4,2 Kb-os Sal 1 DNS-fragmenst reklónozunk pFCl8 ingázó (shuttle) vektor plazmiddal (amely spectinomicinrezisztenciával és tet. raciklinrezisztenciával rendelkezik). A pFC18 előállítását a következő eljárás szerint hajtjuk végre. pCGll-et izolálunk egy pCGll-et tartalmazó Corynebacterium glutamicum törzsből (ATCC 39022) a feltalálók által korábban közzétett eljárás szerint (14500/82 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés, 1. példa, (1) cikkely). Az erre a célra használt pBR322 a Takara Shuzo Co., Japán kereskedelmi forgalomban hozzáférhető terméke. 120 Ml PstI restrikciós enzimhez való reakcióoldathoz (20 mmól 7,5 pH-jú TR1S.HC1, 10 mmól magnézium-klorid, 50 mmól ammónium-szulfát és 0,01% borjú szérumalbumin), amely 4-4 Mg pCGll és pBR322 plazmidot tartalmaz, hozzáadunk 8 egység Pstl-et (a Takara Shuzo Co., Japán terméke), és az elegyet 37 °C-on 60 percig reagáltatjuk. A reakciót 65 X-on 10 percig tartó melegítéssel megszakítjuk. Utána 30 Ml T4 ligáz pufferoldatot, 30 m! 5 mmólos ATP oldatot, 0,3 egység T4 ligázt és 120 pl vizet a-, dunk hozzá, és az elegyet 12 C-on 16 óra hosszat reagáltatjuk. Az Escherichia coli K 12 WA802 altörzsét a ligáz reakciótermékkel az 1. példa (2) cikkelyében bemutatott eljárás szerint transzformáljuk. A 100 Mg/ml spektinomicínt és 25 Mg/ml tetraciklint tartalmazó L táptalajból készített agarlemezen szaporított transzformált mutánsok egyikéből ugyanilyen agartáptalajon egysejttenyészetet izolálunk, és a tisztított törzs tenyésztett sejtjeiből An és munkatársai módszere szerint plazmid DNS-t különítünk el. A plazmid DNS szerkezetét restrikciós enzimes hasítással és agarózgél-leketroforézissel vizsgáljuk és azt találjuk, hogy a plazmid DNS-nek olyan szerkezete van, hogy a pBR322 beékelődik a pCGll egyetlen PstI hasítási helyére (lásd 1. ábra). A plazmidot pFCl8-nak nevezzük. Corynebacterium glutamicumból származó dapA-t és dapC-t tartalmazó rekombináns plazmidot vektorként pFC18-at használva a következő eljárással készítünk. 120 Ml Sál I-hez való reakcióoldathoz, amely 4-4 Mg pFC18 és pCDl plazmid DNS-t is tartalmaz, hozzáadunk 8 egység Sal I restrikciós enzimet, és az elegyet 37 °C-on 60 percig reagáltatjuk. A reakciót 65 196.843 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
