196843. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-lizin előállítására
1 2 °C-on 10 percig tartó melegítéssel megszakítjuk, és utána hozzáadunk 30 pl T4 ligáz pufféroldatot, 30 pl 5 mmólos ATP oldatot, 0,3 egység T4 ligázt és 120 pl vizet Az elegyet 12 °C-on 16 óra hosszat reagáltatjuk. A ligáz reakcióterméket Escherichia coli TM103 törzsbe transzformáljuk. A transzformációt az 1. példa (2) cikkelyében bemutatott eljárás szerint hajtjuk végre, és a transzformált mutánsokat 100 pg/ml spektinomicint tartaimazó M9 minináltáptalajból készített agarlemezen szelektáljuk. Az így kapott, spektinomicinrezisztenciával rendelkező és diamino-pimelinsavat nem igénylő transzformált mutánsok egyikéből izolálunk plazmid DNS-t An és munkatársainak a módszere szerint. Az izolált plazmid DNS szerkezetét restrikciós enzimes hasítással és agarózgél-elektroforézissel vizsgáljuk. Azt találjuk, hogy a plazmidnak olyan szerkezete van, hogy a pCDl-ből származó 4,2 Kb-os Sal I DNS fragmens s pFCl8 egyetlen Sal I hasítási helyére illeszkedik be. A plazmidot pAC2-nek nevezzük. Az említett AZ009 és AZ 997 transzformációját pAC2-vel hajtjuk végre, és megállapítjuk, hogy a spectinomícinrezisztens transzformált mutánsok egyidejűleg kölcsönösen kiegészülnek diamino-pimelinsav igénnyel. (4) pAC2 bevitele Corynebacterium glutamicum RH6 törzsbe: Corynebacterium glutamicum RH6 törzs (amely homoszerin-igényes) transzformációját pAC2 felhasználásával hajtjuk végre 0,1 ml RH6 törzs oltótenyészetet inokulálunk 10 ml SSM táptalajra (literenként 10 g glükózt, 4 g ammónium-kloridot, 2 g karbamidot, 1 g élesztőkivonatot, 1 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 3 g dikálium-hidrogén-foszfátot, 0,4 g magnézium-klorid-hexahidrátot, 10 mg vas(II)-szullat-heptahidrátot, 0,2 mg mangán(II)-szulfát-tetra-hexahidrátot, 0,9 mg cink-szulfát-heptahidrátot, 0,4 mg réz(ll)-szilfát-pentahidrátot, 0,09 mg nátrium-tetraborát-dekahidrátot, 0,04 mg ammónium-molibdenát-tetrahidrátot, 30 pg biotint és 1 mg tiamin-ludrokloridot tartalmazó és 7,2 pH-jra állított táptalaj)^ amely még 50 pg/ml homoszerint tartalmaz, és 30 C-on rázatva tenyésztjük. Amikro az OD eléri a 0,15 értéket, hozzáadunk 0,5 egység/ml-ig penicillin G-t. A tenyésztést tovább folytatjuk, és amikor az OD körülbelül 0,6-ot ér el, a tenyésztett sejteket összegyűjtjük, és 1 mg/rnl lizozimot tartalmazó 2 ml RCPG táptalajban (literenként 5 g glükózt, 5 g casaminosavat, 2,5 g élesztőkivonatot, 3,5 g dikálium-hidrogén-foszfátot, 1,5 g kálium-díbidrogén-foszfátot, 0,41 g magnézium-klorid-hexahidiűtot, 10 mg vas(Il)-szulfát-heptahidrátot, 2 mg mangén(Il)-szulfát-tetra-hexahidrátot, 0,9 mg cink-szulfát-szukcinátot és 30 g 1000 molekulasúlyú polivinilpirrolidont tartalmazó és 7,2 pH-ra állított táptalaj) szuszpendáljuk, és a szuszpenziót 30 °-on 14 óra hosszat enyhén rázogatjuk protoplasztok előállítása céljából. Utána 1 ml protoplaszt oldatot centrifugálunk 15 percig 2500 g-nél a protoplaszt lecsapása céljából. A protoplasztot 1 ml MTSC pufferoldatban (10 mmól magnéziuin-kloridot, 30 mmól kalcium-kloridot, 50 mmól 7,5-pH-jú TRlS.HCI-t és 400 mmól szacharózt tartalmazó oldat) szuszpendáljuk, és centrifugálással mossuk. A protoplasztot 0,1 ml TMSC pufferoldat-6 ban reszuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 20 pl előbb izolált pAC2 plazmid DNS-t adunk, majd utána 0,8 ml TMSC pufferoldatot, amely 20 súly/térf.% 6000 mólsúlyú polietilénglikolt (PEG) tartalmaz. Az elegyhez 3 perc múlva 2 ml RCPG táptalajt adunk, és a protoplasztot 2500 g-nél 5 percig tartó centrifugálással ülepítjük. A protoplasztot 1 ml RCPG táptalajban szuszpendáljuk, és enyhe rázás közben 30 °C-on 2 óra hosszat, tenyésztjük. A protoplaszt szuszpenzió 0,1 ml-ét 400 pg/ml spektinomicint tartalmazó RCPG agar táptalajban (1,4% agart tartalmazó RCPG táptalaj) szélesztjük, és 30 °C-on 6 napig tenyésztjük. Az így kapott spektrinomicinrezisztens transzformált mutánsok egyikéből plazmid DNS-t extrahálunk a jelen találmány feltalálói által korábban közölt eljárás szerint (134500/82 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés, 1. példa (1) cikkely). A restrikciós enzimes hasításos és agarózgél-elektroforézises analízissel azt találjuk, hogy az izolált plazmisnak a pAC2-vel azonos szerkezete van. Az előző cikkelyben végzettel azonos transzformációs testtel azt találtuk, hogy a plazmid rendelkezik az AT998 törzs és az AT997 törzs diamino-pimelinsav igényének , helyreállítására szolgáló ugyanazon funkcióval, mint a pAC2. A törzs, amelynek pAC2-vel való transzformálhatóságát így megerősítjük, a Corynebacterium glutamicum RH6/pAC2. (5) L-Lizin termelései pAC2-t tartalmazó törzzsel: L-Lizin termelést Corynebacterium glutamicum RH6/pAC2 törzzsel és a megfelelő olyan RH6 törzszsel, amely nem tartalmazza a plazmidot, a következő módon hajtjuk végre. RH6/pAC2 törzset és RH6 törzset külön-külön tenyésztünk 3 ml NB táptalajon (1 liter vízben 20 g húskivonatot és 5 g élesztőkivonatot tartalmazó, és 7,2 pH-ra állított táptalaj) 30 °C-on 16 óra hosszat rázatva. Utána 0,5 ml tenyészfolyadékot inokulálunk 5 ml L! termelő táptalajba (literenként 100 g glükózt, 30 g ammónium-szulfátot, 0,5 g kálium-dihidrogén-foszfátot,0,5 gdikálium-hidrogén-foszfátot, 1 gmagnézium-szulfát-heptahidrátot, 10 mg vas(II)-szulfát-. -heptahidrátot, 10 mg mangán(Il)-szulfát-tetra-hexahidrátot, 100 pg biotint, 200 mg homoszerint és 30 g kalcium-karbonátot tartalmazó, és 7,2 pH-ra állított táptalaj), és 30 °C-on rázatás közben 72 óráig tenyésztjük. A tenyésztés után a tenyészfolyadék szűrleiében a termelődött lizint kolorimetriásan kvantitative meghatározzuk a savas réz-ninhidrin eljárással (Chinard, FJX: J. Bioi. Chem. 199, 91 /1952/). Az eredményeket az 1. táblázatban láthatjuk. A táblázatból nyilvánvaló, hogy a Corynebacterium glutamicum dapA-dapC génjeit tartalmazó rekombináns pAC2 plazmid fokozza az RH6 törzs L-lizin-termelőképességét. 1.táblázat L-Lizin-termelés Corynebacterium glutamicum RH6 törzzsel és bevitt pAC2 plazmidot tartalmazó törzzsel Törzs______________________L-lizin (mg/rnl) Corynebacterium glutamicum RH6 14,8 Corynebacterium glutamicum RH6/pAC2 20,0 196.843 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
