196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 len van. Az rFv-ben a teljes aminosav készlet relatíve kis százaléka változik idiotípustól függően. így viszonylag állandó vázzal bíró területek és változó, úgynevezett hipervariálódó szakaszok alakulnak ki. Az rFv C-terminális szakaszában a szekveniák nagyobb mértékben variálódnak, mint az N-terminális végen, és így,, a jelen leírás értelmében tovább módosítható, amikor a természetben előforduló nehéz és könnyű láncoktól még inkább különböző változatok jöhetnek létre. A hipervariábilis szakasz aminosavainak megváltoztatására mutációt okozó szintetikus oligonukleotid építhető be. Az rFv hibrid DNS technikával való előállítását először általánosságban, majd részletesen ismertetjük. Jelentős kötő affinitással rendelkező homogén rFv előállítására az emlős immunrendszerből indulunk ki. Hibridoma vagy más monoklónozott antitestet termelő sejtből izoláljuk a mRNS-t (hírvivő RNS) és felhasználjuk az immunglobulin könnyű és/vagy nehéz láncainak szekvenciáját meghatározó cDNS előállítására. A jobbra és balra eső szekvenciák esetén a változó szakaszt meghatározó DNS valószínűleg vezető (leader) régiót tartalmazó első és befejező szakaszába legalább részben komplementer rövid DNS szekvenciákat (olignukleotidokat) építünk be a primer repair vagy in vitro mutagenezis biztosítására, amikor különleges szakaszok kieshetnek a DNS-ből és beépülhet a transzlációs kontroll jele. In vivo mutageneziskor olyan oligounkleotidot használunk, amely a cDNS egyik szálával heteroduplexet alkot, ha a DNS polimeráz I Klenow-fragmensével kezeljük. Primer reapir esetén hompduplexet kialakító oligonukleotidra van szükség, ilyen esetben is a fenti enzimet használjuk. A folyamatot kétszer végezzük el, egyszer a kódoló szállal, egyszer pedig a nem kódolóval, amikor olyan kétszálú cDNS-t kapunk, amely meghatározza a váltó zó szakaszt, és előre meghatározott helyen tartalmaz za a transzlációs szabályozó jeleket. Ezt a kétszálú cDNS-t megfelelő vektor molekulába, például plazmidba építjük be, amikor olyan hibrid vektor DNS-t kapunk, amely replikálódni képes és megfelelő szabályozó szakaszokat tartalmaz replikációra, szelekcióra és kifejeződésre. A hibrid vektor DNS-t ezután megfelelő gazdasejtbe juttatjuk az rFv könnyű és nehéz polipeptid láncaiban lévő változó szakaszok kifejezésére, majd izoláljuk a polipeptideket. Az rFv könnyű és nehéz polipeptid láncainak változó szakaszait eztkövetően megfelelő reakcióelegyben összekapcsoljuk, amikor létrejön az rFv. Mivel az idiótípusok változnak, a jelen szabadalmi leírásban megadott reakció lépések sorrendjének változtatásával lehetőségünk van a változó szakaszokat meghatározó kódoló-szekvenciák széles körű változtatására. Ugyancsak hasíthatjuk a kétszálú cDNS-t és a vektor DNS-t a használt szabályozó jelek, különösen a promoter optimalizálására. Megfelelően helyezhetjük el a riboszóma kötőhelyet és a változó szakaszt iniciáló kodont abból a célból, hogy optimalizáljuk a polipeptid változó szakaszát meghatározó DNS kifejeződését. A változó szakaszt meghatározó szekvenciát tartalmazó hibrid vektorra) megfelelő gazdasejtet transzformálunk, amikor az információ kifejeződik. A transzformánsokat a vektorban jelenlévő markerek segítségével szelektáljuk, majd klónozzuk és szaporítjuk. A transzformáncok által termelt polipeptidet a sejtek elkülönítésével és a felülúszó izolálásával kapjuk, az adott típusú polipeptidek ugyanis oldatba szekretálódnak. Abban az esetben, ha a polipeptidek nem kerülnek oldatba, a transzformáns sejteket izoláljuk, lizáljuk és elkülönítjük a polipeptidet. Ismert módszereket, például gélelektroforézist, ffakcionált kicsapást, affinitás kromatográfiát, vagy nagynyomású folyadékkronwtográfiát vagy hasonlókat használva növekvő mennyiségű, változó szakaszt hordozó polipeptideket tartalmazó frakciókhoz juthatunk. Az eredeti lizátumot vagy felülúszót, vagy az ebből nyert tömény frakciókat immunméréssel vizsgáljuk és megállapítjuk a változó szakaszt tartalmazó polipeptidek jelenlétét. A szekretált nehéz vagy könnyű láncot az alábbiak szerinti izoláljuk. Monoklónozott immunglobulinra poliklónozott antiszérumot állítunk elő olymódon, hogy megfelelő gerincest a teljes monoklónozott antitesttel immunizálunk, így olyan antiszérum jön létre, amely felismeri a nehéz és könnyű láncok determinánsait. A teljes immunglobulint vagy csak a könnyű vagy nehéz láncot felismerő antitesteket az antiszérumban jelen lévő más antitestektől elkülöníthetjük és tisztíthatjuk. Olyan affinitív kromatográfiás oszlopot készítünk, amely megfelelő hordozóra kovalensen kötve tartalmazza a teljes immunglobulint vagy csak a nehéz vagy könnyű láncot, majd az oszlophoz kötjük és eluáljuk a teljes immunglobulinra, vagy a nehéz vagy a könnyű láncra antitestként viselkedő és az oszlophoz kötődő molekulákat. Az iszlopot denaturáljuk és a tisztított antitesteket eltávolítjuk, majd megfelelő hordozóra kötve kromatografáló oszlopot készítünk az rFv nehéz és könnyű káncainak tisztítására. Abban az esetben, ha a könnyű és nehéz láncok nem szekretálódnak, úgy járunk el, hogy a könnyű és nehéz láncok bioszintézisét meghatározó kétszálú cDNS-t tartalmazó transzformált mikroorganizmusokat folyékony halmazállapotú táptalajon tenyésztjük, tiszta lizátumot állítunk elő például a sejtek lizozimos kezelésével, roncsoljuk a sejtmembránt és az így kapott elegyet centrifugáljuk és összegyűjtjük a felülúszót. A lizátumot immunszorbeiós affinitás kromatográfiáva! (lásd fent) tisztítjuk, specifikus poliklónozott antiszérumot használva. Az oszlophoz kötődött változó szakaszokat tartalmazó proteint megfelelő denaturáló oldószerrel eluáljuk. A nehéz és könnyű láncot tartalmazó eluátumot összegyűjtjük és megfelelően kezelve renaturáljuk a fehérjéket, amikor sorrendben megkapjuk a H-rFv és L-rFv terméket. Renaturáláshoz az eluátumot megfelelő vizes pufferral szemben dializáljuk. A keveréket ezután tovább tisztítjuk megfelelő ligand-affinitív oszlopon átvezetve, a kötődő molekulákat megfelelő denaturáló oldószerrel eluáljuk. A fentiek szerint eljárva renaturáljuk a változó régiókat, amikor olyan oldatot kapunk, amely tartalmazza a különböző célokra használható rFv termékeket. A találmány szerinti eljárással olyan molekulákat állíthatunk elő, amelyek immunglobulinok nehéz és könnyű láncainak változó szakaszait tartalmazzák polipeptid duplexként és amelyek rendelkeznek az immunglobulinok specifitásával. Mivel a találmány szerinti rFv molekulák nem tartalmaznak állandó sza196.842 5 10 15 2C 25 30 35 40 45 50 55 60 3
