196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 kaszt, kevéssé Immunogének és így előállíthatók a kezelendő szervezetre nézve xenogén forrásokból. Ezenkívül a találmány szerinti rFv molekulák nem hetero-Sén, hanem homogén keverékben léteznek. (A különöző hosszúságú láncokat tartalmazó heterogén keverékeket más módszerekkel, például enzimes vagy savas hidrolízissel állítjuk elő.) A találmány szerinti homogén készítményeket homogenitásuk miatt egységesen módosíthatjuk és pontosan meghatározhatjuk terápiás mennyiségüket. A készítmény nem tartalmaz továbbá a teljes immunglobulinokból származó láncokat, amelyek tökéletlen emésztés esetén nem vesztik el immunogén részeiket vagy új immunogén helyek keletkezhetnek rajta. Végül a találmány szerinti eljárással a kívánt rFv-ből jó kitermeléssel és nagy tisztaságban állíthatunk elő nagyobb mennyiségű terméket. A találmány szerinti eljárással továbbá olyan megfelelő transzformáló kifejeződő vektorokat és plazmidokat állíthatunk elő, amelyek hordozzák az adott rFv molekulákat meghatározó kétszálú DNS-szekvenciákat, előállíthatunk a kifejeződő DNS vektorokat tartalmazó transzformált gazdasejteket, például baktériumokat, mint például E. colit vagy élesztőket, a találmány szerinti eljárás során transzformált kifejeződő vektor DNS molekulákat állítunk elő és a transzformáit sejtek tenyésztésével előállítjuk a megfelelő rFv molekulákat. A találmány szerinti eprássál előállított transzformáló kifejeződő vektor vagy plezmid DNS molekulák olyan kétszálú DNS-szekvenciát tartalmaznak, amely meghatározza egy előre meghatározott ligandra specifikus immunglobulin könnyű vagy nehéz láncának változó szakaszát és nem tartalmaznak olyan-nukleotidokat, amelyek a fenti változó régión Ícívüleső aminosavakat kódolnak, a DNS-szekvencia hordozza továbbá az 5 -, illetve a 3’- végen az iniciációs, illetve a terminációs kodonokat. A liganid lehet például enzim vagy egy felületi fehéije. A kétszálú DNS-szekvencia kódolhatja például a 95—125,előnyösen 95—115 aminosavból álló nehéz lánc változó szakaszát, elsősorban legalább a nehéz lánc D régióját. A találmány tárgya eljárás előre meghatározott liganidra specifikus immunglobulin könnyű vagy nehéz láncának változó szakaszát meghatározó kétszálú DNS-szekvenciát tartalmazó transzformáló kifejeződő vektor vagy plazmid DNS előállítására, amely DNS nem tartalmazza a fenti változó szakaszon kívüleső aminosavakat kódoló nukleotjdokat, de hordozza a 3 - végén a terminációs és az 5 -végen az iniciációs kodonokat. A fenti vektor vagy plazmid DNS molekulák előállítására a találmány értelmében úgy járunk el, hogy kétszálú, a könnyű vagy nehéz láncok legalább egyikét meghatározó cDNS-t állítunk elő a fenti láp cokat kódoló mRNS-ből, az adott változó szakaszon kivüleső nukleotid-szekvenciákat eltávolítjuk a kétszálú cDNS-ről és beépítjük az iniciációs, illetve a terminációs kodonokat a DNS-szakasz 5’-illetve 3-végeire, amikor olyan hasított cDNS-t kapunk, amely az adott változó régiót határozza meg, majd az adott, hasított kétszálú cDNS molekulát beépítjük egy kifejeződő vektor DNS-be, amikor az adott kétszálú cDNS kifejeződik. Az iniciációs és terminációs kodonokat ln vitro mutagenezissel építjük be. Adott esetben beiktathatunk egy további lépést is a fenti mutagenezis előtt, amelynek során a kétszálú cDNS legalább egy nukleotidját olyan kodonná változtatjuk, amely egy másik aminosav beépülését határozza meg. A találmány értelmében részletesen úgy járunk el, hogy a) egy immunoglobulin állandó és változó szakaszból álló, ahol a változó régió 95-125 aminosavból áll, könnyű vagy nehéz láncát meghatározó cDNS-t izoláljuk, a cDNS előállítására reverz transzkriptázzal kezeljük az mRNS-t, kétszálú cDNS előállítására DNS polimerázzal létrehozzuk az egyszálú cDNS komplementer szálját, ahol a kétszálú cDNS kódoló szálja meghatározza az adott könnyű vagy nehéz láncot és ahol a kódoló szálak az adott immunglobulin vezető szekvenciáját a változó és állandó régiót meghatározó szekvenciát tartalmazzák 5 -3 -irányban, majd az előállított kétszálú cDNS-t klónozzuk, b) az adott klónozott kétszálú cDNS-ből kódoló és nem kódoló egyszálú cDNS szálat állítunk elő, és ezután a c., d., e., f. lépéseket decf vagy cedf sorrendben elvégezzük, c) a nem kódoló szál vezető szakaszt és változó szakaszt meghatározó helyei kapcsolódásának pontján olyan oligonukleiotid prímért építünk be, amely az iniciációs hely létrehozásához alkalmas iniciációs kodont tartalmaz, amikor megkapjuk az első duplex molekulát, ezt a duplexet enzimesen kezeljük abból a célból, hogy az első oligonukleotid prímért 5 -3-irányban a nem kódoló, egyszálú cDNS szál mentén meghosszabbítsuk, majd ezután az oligonukleotid primerrel komplementer szállal ellenkező irányban leemésztjük a nem kódoló egyszálú cDNS szakaszt, amikor N-terminálissal meghatározott kétszálú cDNS( kapunk, d) a változó és az állandó szakaszt meghatározó DNS-szekvenciák találkozási pontjába egy második olyan oligonukleotid prímért hibridizálunk, amely stop anti-kodont tartalmaz, amikor létrejön a második duplex molekula, ezt a duplexet enzimatikusan kezeljük a kódoló szálra komplementer 5 -3’-irányú második oligonukleotid primer meghosszabbítása és a másik irányban elhelyezkedő kódoló egyszálú cDNS-t leemésztve C-terminálisan végződő kétszálú cDNS-t hozunk létre, e) az előállított C- vagy N-terminálisan meghatározott kétszálú cDNS-t klónozzuk, a kapott C- vagy N- terminálisan meghatározott cDNS-t kódoló és nem kódoló szálakra választjuk szét, végül a kódoló szálat használjuk, ha a d. lépés következik, de a nem kódolót, ha a c. lépést végezzük el, ezután, végül f) a kapott N- és C-terminálisan végződő cDNS-t klónozzuk, és a fenti, az adott kódoló szekveniát tartalmazó kétszálú cDNS-t a transzkripciós és transzlációs szabályozó jelekkel megfelelő összefüggésben beépítjük egy kifejeződő vektorba vagy plazmidba. A találmány egy előnyös kivitelezési változata szerint úgy járunk el, hogy A), előállítunk egy immunglobulin könnyű vagy nehéz láncát meghatározó kétszáló cDNS-t, ahol a szálak mindegyike egy állandó és egy változó szakaszból áll, és ahol a változó szakasz 95-125 aminosavat tartalmaz, a cDNS előállítására az adott láncot meghatározó mRNS-t izoláljuk, majd reverz transzkriptázzal előállítjuk a megfelelő egyszálú cDNS-t, 196.842 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
