196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 Az emlős immunrendszer egyedülálló képessége azon nagyszámú immunglobulinoknak nevezett protein bioszintézise, amelyek kiemelkedően magas specifításúak egy adott molekulaszerkezetre. Ezen proteineknek olyan a konformációjuk, hogy egy adott struktúrához specifikusan képesek komplementálódni, így nagy affinitású kötődés jön létre. Ily módon az emlős immunrendszer válaszolni képes idegen molekulák, különösen mikroorganizmusok felületi membránjain lévő proteinek, toxinok inváziójára, amikor a behatoló test detoxifikálódik vagy felbomlik anélkül, hogy a gazdaszervezetre hatással lenne. A védekező rendszer elsődleges immunglobulinja a gamma-globulin (IgG). Ennek a 150 000 dalton molekulasúlyú glikoproteinnek négy lánca van, két úgynevezett nehéz lánc és két könnyű lánc. Mindegyik láncon találunk egy változó és egy állandó szakaszt. A változó szakaszoknak köszönhető az immunglobulin kötődő képessége, míg az állandó szakaszok több más, az antitest affinitással közvetlenül nem összefüggő funkcióval rendelkeznek. Bizonyos helyzetekben előnyös lenne, ha rendelkeznénk az immunglobulinoknál kisebb, de az immunglobulinok specifitásával és affinitásával bíró kötő molekulákkal. A kisebb molekulák rövidebb ideig tartózkodnak az emlős szervezetben. Ezenkívül, amikor az immunglobulin egy másik molekulához már hozzákötődött, gyakran előnyös, ha az így keletkező termék kisméretű. Gazdaságosabb is, ha kisebb molekulák képesek ellátni a nagyméretűek funkcióját. Bizonyos helyzetekben előnyös nagyszámú molekulát szorosan együtt tartani. Kisebb molekulákat használva nagyobb számú molekulát juttathatunk egy adott kis térbe. Ezenkívül, ha a fenti kötő molekulákat hibrid DNS technikával állíthatjuk elő, megvan a lehetőségünk arra, hogy a molekula kötő részét több más polipeptidhez kapcsoljuk, így előállíthatunk olyan kötő molekulát, amelyek egy adott poli-Eeptid lánc egyik vagy másik végéhez kovalens kémiai ötéssel kapcsolódnak. Amikor az immunglobulinokat in vivo diagnózishoz vagy terápiáson használjuk, immunogén lehet az ailogén gazdaszervezet antiszéruma vagy egy monoklónozott antitest. Ha más molekulacsoportokat használunk az antitesthez, a képződő termék immunogénné válik és megindul a gazdaszervezet antitest képzése az immunglobulin állandó szakaszával vagy a molekula más részével szemben. A fentiek alapján fontos lenne olyan módszerek kifejlesztése, amelyek révén lehetővé válna egy adott antigénnel vagy liganiddal szemben erősen specifikus kötő molekulákat tartalmazó homogén készítmények előállítása, amelyek azonban a teljes immunglobulinok hátrányaival nem rendelkeznek és bírnak a kis molekulasúlyú molekulák előnyeivel. Az immunglobulinok nehéz és könnyű láncaival kapcsolatos problémákra vonatkozóan ajánljuk Sharon és Givol (Biochem., 15., 1591-1594, 1976) Rosenblatt és Hood (Genetic Engineering, 3, 157-188, 1981) munkáit. Az egér immunglobulinjának könnyű láncát baktérium kiónban Amster és munkatársai (Nucleic Acids Res., 8, 2055-2065, 1980) állították elő. A leírás során megadott közleményekben módszereket és készítményeket írnak le. A találmány tárgya eljárás új protein-komplexek előállítására. A találmány szerinti homogén készítmények tartalmazzák egy adott immunglobulin könnyű és nehéz láncainak változó szakaszait, ezek pedig külön-külön vagy együtt egy adott antigént előre meghatározott hapten szakaszon specifikusan kötő komplexet alkotnak. A találmány szerinti homogén készítmények két, egy adott immunglobulin változó szakaszának legalább egy részét meghatározó aminosav-szekvenciáját tartalmazó, de az állandó szakaszt gyakorlatilag nem tartalmazó polipeptid láncból álló specifikus kötő készítmények, ahol a nevezett imminglobulin egy adott, előre meghatározott liganddal szemben kötő aktivitással bír. A két polipeptid lánc az előre meghatározott ligandot erősen kötő komplex molekulává alakul. A polipeptid láncokat genetikai úton, génsebészettel készített mikroorganizmusok tenyésztésével állítjuk elő. Hibrid DNS technikát használva a cDNS-ről lehasítjuk a könnyű és nehéz lánc változó szakaszairól a felesleges nukleotidokat. A kapott kétszálú cDNS-t megfelelő kifejeződő vektor molekulába építjük be, majd transzkripcióra és transzlációra sejtbe juttatjuk. A kapott könnyű és nehéz láncok a változó szakasz legalábbis nagy részét meghatározzák és olyan komplex molekulává alakulnak, amely erős affinitással specifikusan kötődnek egy antigén vagy liganid hapten helyéhez. A kötődési konstans általában nagyobb, mint 10s .gyakran nagyobb mint I06, előnyösen nagyobb, mint 10*. A liganid kötésére a könnyű és nehéz láncok változó szakaszait tartalmazó polipeptid láncokat általában együtt használjuk. Esetenként azonban használhatunk egyetlen láncot is, ha ennek megfelelő kötő affinitása van a kérdéses liganiddal szemben. A találmány szerinti készítményekben lévő két polipeptid lánc, egyenként vagy együttesen, egy adott immunglobulin kötőhelyével analóg receptor helyet alkot. A készítményt rFv jellel jelöljük, az egy láncot tartalmazót pedig L-rFv-(könnyű lánc) vagy H-rFvnek (nehéz lánc). A két lánc is lehet, származhat a könnyű vagy nehéz lánc szekvenicájából. Az rFv polipeptid lánc általában 125-nél kevesebb aminosavat tartalmaz, előnyösen 95-nél; még előnyösebben 100- nál többet. A H-rFv lánc előnyösen 110 és 125 közötti számú, az L-rFv lánc pedig 95 és 115 közötti számú aminosavat tartalmaz. Az adott idiotípustól függően a készítmény aminosav összetétele széles határok között változik. A 60—75 aminosav között általában két cisztein van, ezek diszulfid-kötést (cisztin) alkotnak. A két lánc általában az immunglobulinok könnyű és nehéz láncaiban található változó szakaszok idiotípusainak másolata, esetenként azonban elegendő, ha a könnyű vagy a nehéz lánc változó szakaszai kombinálódnak. Gyakran előnyös, ha az rFv egyik vagy mindkét lánca például radioizotóppal, fluoreszkáló molekulával vagy toxinnal jelölt, vagy semleges, élettani szempontból elfogadható vivőanyagokhoz, például szintetikus szerves polimerhez, poliszacharidhoz, természetes proteinekhez vagy más, nem immunaktív anyaghoz van kötve. Esetenként előnyös, ha a két protein lánc például a karboxil-terminális végén lévő ciszteinnel kovalensen kapcsolt. A láncokat általában úgy állítják elő, hogy az állandó szakaszok hiányoznak, a J szakasz részben vagy teljesen jelen lehet, vagy hiányozhat. A D szakasz a H-rFv transzkripciós másolatában általában je-196.842 5 10 15 20 25 30 35 40 4í 50 55 60 2
