196833. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sztatint vagy származékait tartalmazó peptid származékok előállítására
1 2 196 833 gos artériás vérnyomást a nyaki verőér katéterén mérjük egy Statham P 23 D nyomásátvivő és egy fuiográf segítségével. A stabilizálódási idő után testsúly-kilogrammonként 30 80 mii sertés renint adva intravénásán, 20 30 higanymilliméteres, kontrollként tekintett rcnin vérnyomásemelkedést (dP) kapunk. Miután az átlagos artériás vérnyomás visszatért az alapvonalra, testsúly-kilogrammonként 10 mg reningátlót adunk be intravénásán, az állatok a reningátló beadását követő 5., 15. és 30. percben a kontroll mérésnél alkalmazott dózisú sertés renint kapnak ismét, és rnétjük a kiváltott vérnyomásemelkedést (dP). Az antagonizmus százalékos értékét a következő képlet segítségével számítjuk ki: (Kontrol! dP - kísérleti dP) x 100,«, koiTtrolldP ahol a kontrol dP és a kísérleti dP az átlagos artériás vérnyomás változása a reningátló beadása előtt, illetve után. Minden kísérletnél legalább három állatot használunk, és az. értékeket átlagoljuk. A fenti eljárást alkalmazva, megállapíthatjuk a találmányban szereplő vegyületek százalékos antagonizmusát a renin által kiváltott vérnyomásemelkedéssel szemben. 22. példa N-(Tercier-butoxi-karbonil)-Phe-N-metil-His-cSta-Lys-Phe a) lépés N-íMTcrcier-butoxi-karboniO-N-epszilon-benziloxi-karbonil-lizin-fenil-alanin-benzil-észter 50 ml 0°C hőmérsékletű diklór-mctánban egymás után. az alábbi sorrendben feloldunk 162 mg (1,2 mmól) 1-hidroxi-benzolriazolt, 101,2 mg (1 mmól) N-metil-morfoIint, 428 mg (1 mmól) L-fenil-alanin-benzil-észter-p-toluol-szulfonátot, 456 mg (i ,2 mmól) N-a-(tercier-butoxi-karboniI)-N-epszilon-benziloxi-karbonil-L-lizint és 635 mg (1,2 mmól) 80%-os tisztaságú 1 -ciklohexiI-3-)2-morfolinil-etil)-karboddimid-mcto-p-toluol-szulfonátot, és a kapott oldatot 19 órán át 20°C hőmérsékleten keverjük. Ezután az elegyet 75 ml 5,5%-os, vizes sósavval, utána 75 ml telített, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd 75 ml telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, és vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk. A szárítószert kiszűrjük, és a szőriéiről az oldószert ledesztilláljuk. Ily módon habos anyag formájában 669 mg nyersterméket kapunk. 1 H-NMR-spektrum (CDCI3, delta): 1,5 (s, 9H, tercier-butoxi-karbonil-csoport). Ezt a nyersterméket további tisztítás nélkül használjuk fel a következő reakciólépésben. b) lépés N-epszilon-Bcnziloxi-karbonil-lizin-fenil-alanin-bcnz.il-észter-hidroklorid 5,6 g (10 mmól), az a) lépésben leírt módon kapott N-Or(tcrcier-butoxi-karbonil)-N-epszilon-benziloxi-karbonil Iizín-alanin-benzil-észtcrt 20°C hőmérsékleten feloldunk 25 ml 4 normál dioxános sósavoldatban. a reakcióclegyet keverjük, és a reakciót vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel követjük (futtató elegy: etil-acetát és hexán elegye). A reakció befejeződése után a terméket dietil-éterrel háromszor kimossuk, majd először 10 ml forró diklór-metánból, majd 30 ml dietil-éterből átkristályosítjuk. A kristályos anyagot kiszűrjük, dietil-éter és diklór-metán 3 : 1 arányú, lehűtött elegyével háromszor 5 kimossuk, és éjszakán át szobahőmérsékleten szárítjuk. Ily módon fehérszínű, porszerű anyag formájában 4,51 g terméket kapunk. c) lépés (N-/tercier-Bu toxi-karbonil/-ciklosz. tatin )-/N-epszilonh q -benziloxi-karbonil-lizin/-fenil-alanin-benzil-észter 1 10 ml diklór-metánban 0 C hőmérsékleten egymás után, az alábbi sorrendben feloldunk 2,46 g (4,44 mmól) a b) lépésben kapott (N-epszilon-benziloxi-karbonil-lizin)-fenil-alanin-benzil-észter-hidrokloridot, 1,4 g (4,44 mmól) N-(tercier-butoxi-karbonil))5 -ciklosztatint, 1,021 g (6,66 mmól) 1-hidroxi-benzotriazolt, 1,980 g (4,44 mmól) morfolinil-etil-ciklohexil-karbodiimidet és 0,801 ml (5,77 mmól) trietil-amint. A reakcióelegyet éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, majd a kapott oldatot az a) lépésben leírt módon dolgozzuk fel. Ily módon halványsárga 20 színű, szilárd anyag formájában 4,22 g terméket kapunk. *fl-NMR-spektrum (250 MHz, CDCI3, részleges spektrum): 1,45 (s, 911, tercier-butoxi-karbonil-csoport), 25 0,8 1,9 (átfedő m), 2,2-2,5 (m, 2H), 3,05 -3.2 (m, 411), 3,6 3,92, 4,0, 4,35, 4,72 4,88 és 5,0 (m. 1 111), 5,0 5,2 (m, 4H), 6,45 és 6,55 (d, Ili-III), 7,03 (m, 2H), 7,2 -7,5 (m, aromás). d) lépés 30 Ciklosztaiin-(N-cpszilon-ben/.iloxi-karbonil-lizin)-fenil-alanin-benzil-észter-hidroklorid 2,144 g (2,63 mmól), a c) lépésben leírt módon kapott (N-/tercier-bufoxi-karbonil/-ciklosztatin)-/N-cpszilon-benziloxi-karbonil-lizin/-fenil-alanin-benzil-észtert feloldunk 4 normál dioxános sósav- 35 -oldatban, és az oldatot 1 órán át 20°C hőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután az elegyet a b) lépésben leírt módon dolgozzuk fel. ily módon fehérszínű, porszerű anyag formájában 1,80 g terméket kapunk. ^H-NMR-spektrum (250 MHz, DMSO-d^, részleges 40 spektrum): 0,7-0,9 (m, 2H), 1,0-1,8 (m, 12-1411), 2,38 és 2,57 (dd, 1-1H), 2.9- 3,1 (m, 4-5H), 3,2, 3,9 5,63 (m, 1-111), 4,25 és 4,52 (dt, 1-111), 5,0-5.2 (m, 4H), 7,15-7,45 (m, körülbelül 13H), 7.82 (széles, 3H), 8,2 és 8,52 (d, 1-1H). 45 e) lépés (N-űz/tercier-Butoxi-karbonil-fcnil-alanin/-N-im-/tercicr-butoxi-karbonil/-N-metil-hisztidin)-ciklosztatin-/N-epszilon-benziloxi-karbonil-liz.in/-fenil-alanin-benqq zil-észter el) lépés N-Metil-L-hisztidin-mctil-észter-dihidro-klorid 1 g N-meti^L-hisztidint feloldunk metanolban, és az oldatba 0°C hőmérsékleten néhány percen át 55 gázalakú sósavat vezetünk. Utána az elegyet másfél órán át forraljuk, és eközben többször újra sósavat vezetünk bele. Ezután az oldatot lehűtjük, és az oldószert csökkentett nyomáson ledcszlilláljuk. A termék nagyfelbontású folyadék-kromatográfiás vizsgálata azt mutatja, hogy az elegyben körülbelül 7% 60 mennyiségű reagálatlan kiindulási anyag maradt. 13
