196833. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sztatint vagy származékait tartalmazó peptid származékok előállítására
2 1 ■ 196 833 Rj. = 0,50 (but.anol/ecetsav/víz 4 : 1 : 1, ninhídrinnel előhívva). 5 * fl-NMR (CD,OD):. 5 0,6-2,4 (m, 23H), 1,37 . (s, 911). 7,1 -7,4 (UH), 6,95 (s, 1H), 7,70 (s, 1H). 12. példa Az 1. példában leírtak szerint, de az L-fenil-alanin-benzilészter-p-toluolszulfonát helyett sztatin-benzilésztenhidrokloridot és az N-/t-butil-oxi-karbonil/-sztatin helyett N-/t-butil-oxi-karbonil/-cikIosztatint használva (N-/t-butil-oxi-karbonil/-fcnilalanin)-hisztidin-ciklosztatin-lizin-sztatint állítunk elő. 1H-NMR (CD^OD):5 1,5 (s, 9H, BÖK). 13. példa Az (N-/t-butil-oxi-karbonil/-fenilalanin)-hisztidin-ciklosztatin-(3-metoxi-karbonil-l ,2,3,4-tetrahidro-2- -izokinolin) előállítását a következő reakciólépéseken keresztül végezzük A) Az (N-/t-butil-oxi-karbonil/-ciklosztatin)-/3-metoxi-karbonil-l,2,3,4-tetrahidro-2-ízokinolint/ az 1. példa C) reakciólépése szerint állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy az N-/t-butil-oxi-karbonil/-sztatin helyett 190 mg (0,60 mmól) N-(t-butiI-oxi-karbonil)-ciklosztatint és az (N-cpszilon-bcnzil-oxi-karbonil-lizin)-fenilalanin-benzilés7.ter-hidroklorid helyett 137 mg (0,60 mmól) 3-metoxi-karbonil-l ,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-hidrokloridot használunk. A kapott 301 mg habos terméket további tisztítás nélkül használjuk fel a következő lépésnél. B) Az 1. példa D—H) rcakciólépéscinél leírtak szerint 391 mg (N-/t-butil-oxi-karbonil/-fenilalanin)-hisztidin-ciklosz tatin-(3-mctoxi-karbonil-l,2,3,4-tctrahidro4- -izokinolin)-t állítunk elő. A hab formájában nyert terméket szilikagélen kromatografálva tisztítjuk, eluensként kloroform/metanol elegye! használva, így 138 mg tisztított termékhez jutunk fehér szilárd anyag formájában. 1 H-NMR (CDCI3): 5 1,5 (s. 9H, BÖK). 14 -18. példa A 13. példában leírtak szerint, de a T-metoxi-karbonil-1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin helyett a megfelelő izokinolin-, kinolin- vagy piperidinszármazékot használva az alábbi (N-/t-hutil-oxi-karbonil/-fcnilalanin)-hisztidin-ciklosztatin-R* képletű vegyületeket állítunk elő. Példa TGO ’ll NMR-spektrum (CD^OD), delta:____ 14. l,2,3,4-tetrahidro-2-izokiniliníl 15. 3-amino-karbonil-l,2,3,4- tetrahidro-2-izokinoIinil 16. 1,2,3,4-tetrahidro-l-kinolinil 17. 4-fenil-metil-l-piperidinil 18. 3-metoxi-karbonil-1,2,3,4,5,-6,7,8-dckahidro-2-izokinolinil 1.5 (911, s), 6,8- 7,9 (11H, m) 1.5 (9H, s) 1.5 (9H, s), 6,85 7,8 (11H, m) 1.5 (9H, s), 7,0- 7,30 (1 OH, m) 1.5 (9H, s), 3,8 (3H,s) 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 19. példa Az (N-/t-butiloxi-karbonil/-fenilalanin)-hisztidin-ciklosztatin-prolin-mctil-észter előállítását az alábbi reakciólépéseken keresztül végezzük. A) Az 1. példa C) reakcíólépése szerint 3,945 g fehér, szilárd (N-/t-butiloxi-karbonil/-ciklosztatin)-prolin-metil-észtert állítunk elő, azzal a különbséggel, hogy az N-(t-butil-oxi-karbonil/-sztatin helyett 3,15 g (10 mmól) N-/t-butil-oxi-karbonil/-ciklosztatint az (N-epszilon-benzil-oxi-karbonil-lizin/-fenilalanin-benzil-észter-hidroklorid helyett 1,65 g (10 mmól) prolin-metilészter-hidrokloridot használunk. B) Az 1. példa D H) reakciólépéseinél leírtak szerint (N-/t-butil-oxi-karbonil/-fenilalanin)-hisztidin-ciklosztatin-prolin-metilésztert állítunk elő. ^-NMR-spektrum (CD,OD): 51,5 (9H, s), 3,8 (3H, s), 7,2 (5H, s). 20. példa A renin angiotenzinogént hasító aktivitásának in vitro gátlását az alábbiak szerint vizsgáljuk. Az. egészséges személyektől nyert vérplazmát felhasználásig fagyasztva tároljuk. Felhasználás előtt kellő mennyiségű plazmát felolvasztunk és centrifugáljuk. A -fclülúszót proteázgátlókkal keverjük össze, és a kémhatást pH = 7,4 értékre állítjuk. A plazmafelülúszó különböző mennyiségeihez reningátlókat adunk különböző töménységben, és a kapott keverékeket (310 lambda) három órán keresztül 37 C hőmérsékleten tartjuk, olyan kontrollal együtt, ami rcningátlót nem tartalmaz. Az inkubáció után a reakciót jeges víz hozzáadásával leállítjuk, és a mintákat az angiotenzin I szempontjából vizsgáljuk angiotenzin 1 antitestekkel. A reningátló jelenlétében történő angiotenzin I termelődését összehasonlítjuk az inhibitort nem tartalmazó minták angiotenzin I termelődésével, és a gátlás mértékét százalékosan fejezzük ki. A különböző gátlókoncentrációk párhuzamos kísérleteiből megállapítjuk azt a koncentrációt, ami a renin angiotenzinogén hasító aktivitásának ötvenszázalékos gátlását okozza, azaz az ICjq értéket, és ezt valamennyi vizsgált gátlórameghatározzuk. A kioltott reakciójú minta angiotenzinogén I mennyiségét radióimmun vizsgálatokkal állapítjuk meg, a Becton Dickonson and Co. (Orangeburg, N. Y., USA) cég renin-radioimmunassay készletét használva. Ezt a radioimmun vizsgálatot Haber és munkatársai fejlesztették ki (J. Gin. Endocrin. (1969) 29, 1349-1355). Az említett eljárást alkalmazva, a reningátlás hányadosát az 1—5. és 7—20. példában előállított vegyietekre határoztuk meg. Az IC<-q érték minden esetben kisebb volt a literenkénti 5 mikromólnál. 21. példa Az exogén renin által kiváltott vérnyomásemelkedés antagonizmusát in vivo az alábbiak szerint vizsgáljuk 230-300 g testsúlyú hím Sprague-Dawley patkányokat testsúly-kilogrammonként 65 mg dózisban intraperitoneálisan adott nátrium-pentabaritáttal elaltatjuk, majd mindegyik állat comb-vénájába és a nyaki verőérbe katétert ültetünk. Folytatva a műtétet, az állatot hasonfekvő helyzetbe hozzuk, és folyamatosan mérjük a végbél hőmérsékletét. Az átla-12
