196832. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazma-proteinek elválasztására sejttenyészetekből
1 2 A humán kromoszómák meghatározott részeiből klónozott DNS szakaszok izolálására más módszereket (mák le Gusella és munkatársai (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77 (5), 2829-2833 /1980/). Nyilvánvaló, hogy a jelen találmány nem korlátozódik egyetlen gazda-vektor rendszerrel sem a plazmafehérjék génsebészeti előállítása területén, a találmány tárgya ehelyett plazmafehérjék elválasztása sejttenyészet rendszerből, a sejtek megfelelő sejttenyésztő közegben való növesztése után, függetlenül attól, hogy a plazmafehérjék hogy kerültek a tenyészetbe. A sejttenyészet tápközegének olyan kémiai összetételinek kell lennie, hogy kielégítse a sejttömeg kémiai elem igényeit és megfelelő energiát szolgáltasson a szintézishez és fenntartáshoz. A mikrobiális sejt tipikus elemösszetétele a következő lehet: Elem Sejt szárazanyag % C 50 N 7-12 P 1-3 S 0,5-1 Mg 0,5 Egy megfelelő táptalajnak olyannak kell lennie, hogy pótolja az adott sejt növekedéséhez szükséges kémiai elemeket. Kistérfogatú mikrobiális sejttenyészetek megszokott táptalajai általában húskészítményeken alapszanak (triptikus emésztés, pepton, tápleves), melyek hús vagy hal enzimes hidrolízisének oldható terméke. Vitaminok és koenzimek (általában mg/liter mennyiségben) pótlására, a táptalajokat gyakran tovább gazdagítjuk húskivonattal (hús infúzió) vagy élesztő kivonattal. Szükség esetén ásványi sókat, úgymint nátrium-kloridot, dikáliun-hidrogén-foszfátot és magnézium-szulfátot és különböző. aminosavakat adhatunk hozzá. Véres-agar táptalajokban a vér szolgáltatja a további tápanyagokat. A szérumokat is használhatjuk, amelyben az albumin komponens szolgál védő, nem-tápanyag jellegű faktorként. Szénvegyületek, úgymint glükóz, laktóz és maltóz szolgáltathatják a sejtek szén-szükségletét, valamint a szükséges energiát. További illusztrálás céljából. E. coli tipikus minimális táptalaja a következő lehet: Anyag Gm/liter k2hpo4 7,0 kh2po4 3,0 Na^ citrát. 3H20 0,5 MgS04.7H20 0,1 FeS04 0,01 (nh4)2so4 1,0 Glükóz 1,0 Nagyobb léptékű fermentációban az alkalmas fermentációs közeget szénhidrát anyagokból, úgymint tejsavó, lebontott kukorica-keményítő, kukorica-cukor, melaszok, keményítő-cukor, búzakorpa és más elérhető szénforrásból, valamint nitrogéntartalmú anyagokból, úgymint sűtőélesztő, szójafehérje, kazein, karbamid, ammóníum-sók, nitrátok és más elérhető nitrogén-fonásokból készíthető. Ezek a fermentációs táptalaj-adalékok lehetnek nyersanyagok, vagy tisztított anyagok. Az N-Z-Amine fehérje hidrolizátum, kukoricalekvár, szeszfőzési maradék kereskedelmi forgalomban levő komplex anyagok, melyek hasznos táp-komponenseket szolgáltathatnak a mikrobiális sejttenyészet rendszerhez. Az N-Z-Amin a tejiparban melléktermékként keletkező kazein enzimes emésztésével állítható elő. A kukoricalekvár a kukoricakeményítő feldolgozásának mellékterméke, és komplex anyagokat tartalmaz, ideértve számos fehérje-hidrolízis terméket, B-komplex vitaminokat, aminokat és más szerves és szervetlen anyagokat. A szeszfőzési maradék az alkoholos italok gyártásának mellékterméke. A mikroorganizmusok által esetleg igényelt nyomnyi mennyiségű tápanyagok általában benne vannak a fontos fermentációs táptalaj komponensekben, úgy, hogy külön hozzáadásukra általában nincs szükség. Például szervetlen sók, úgymint fém-kloridok, szulfátok, foszfátok és nitrátok általában a fontos szén- és nitrogén-forrás adalékanyagokkal kapcsolatban jelen vannak a fermentációs táptalajban. Hasonlóképpen, emlős és más gerinces állatok sejtjeinek növesztésére alkalmas táptalaj emészthető nitrogén- és szénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmaz. Ez lehet bármely jól ismert szövettenyésztő táptalaj, például Eagle Alaptáptalaj (BME), Eagle Minimálisan szükséges Táptalaj (NEM), Dulbecco Módosított Eagle Táptalaj, 199-es Táptalaj és kiegyensúlyozott sóoldat (BSS), úgymint az Eagle és Hanks által különböző tápanyagokkal megerősített oldatok. Ezek a kereskedelmi forgalomban elérhető szövettenyészet táptalajok, és részletesen H. J. Morton ismerteti őket (In Vitro 6, 89- 108 /1970/). Ezek a szokásos tenyésztő táptalajok ismert esszenciális aminosavakat, ásványi sókat, vitaminokat és szénhidrátokat tartalmaznak. Ezenkívül gyakran gazdagítják őket emlős szérumokkal, például borjú-magzat szérummal. A májnak a plazmafehéijék bioszintézisében elfoglalt uralkodó szerepét figyelembe véve, a jelen találmány egyik szempontjából következően a májsejtek az előnyben részesített emlős sejtek a plazmafehérje komponensek előállításában és elválasztásában. A tumorsejtek tenyészetei különösen hasznosak a találmány szerinti eljárásban a,véralvadásért felelős plazma-komponensek esetében. így ismert az, hogy a véralvadási abnormali fásokat általában daganatos betegeknél figyelik meg, és fibrin lerakódásokat találtak számos elsődleges és áttételes tumor körül emberben és állatokban. Lásd például (Dvorak et al., Science, 212, 923 -924 /1981/). Az is jól ismert, hogy tenyésztett hepatóma sejtekből albumin nyerhető ki. A plazma-komponensek emlős sejttenyészet rendszerekből való elválasztását részletesen bemutatjuk az alábbiakban az emberi VH-as faktornak SK-HEP-1 jelű emberi máj-adenokarcinóma sejtvonal sejttenyészet rendszerekből való elválasztásán. Az SK-HEP-1 stabilizált sejtvonalat G. Trempe állította elő (Sloan-Kettering Istitute for Cancer Research) 1971- ben máj-adenokarcinómából, és a sejtvonal tenyészetei ebből az intézetből megszerezhetők. Az SK-HEP-1 sejtvonal stabilizálásáról és jellemzéséről szóló közlemények közé tartoznak a következők: 196 332 5 10 15 20 25 30 35 4C 45 50 55 60
