196832. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazma-proteinek elválasztására sejttenyészetekből
Fogh and Tremplc, „New Human Tumor Cell Lines', a Human Cells in Vitro kiadványában. (Szerk. Fogh), Plenum Publ. Corp., New York, 115 154,1975, ' Fogh et al, J. Nat. Cancer Inst., 58, 209—214 (1977). és Fogh et al., J. Nat’l. Cancer Inst., 59, 221 — 225 (1977). A találmány szerinti eljárás egy, a Vlll-as faktor fehérje sejttenyészet rendszerekből való elválasztását bemutató példájában a polielektrolit előnyösen 3-7 mól % függő di-kis szénatomszámú alkil-amino-, kis szénatomszámú alkil-imid) funkciós csoportot tartalmazó, körülbelül 3—10 mól% kis szénatomszámú alkil-imino-bis(kis szénatomszámú alkil-amin)-nak térhálósított etilén és maleinsav-anhidrid kopolimer, a továbbiakban azzal jellemezhető, hogy lényegében az összes megmaradó karboxil vagy anhidríd csoportok alkoxialkil-aminnal vannak blokkolva. A kopolimer előnyösen metilimino-bisz.-propilaminnal van térhálósítva és függő funkciós csoport dimetil-amino-propilimid. Ebben a bemutató példában az elválasztási eljárásban használt poli elektrolit koncentrációja részben a kezelt sejttenyészet rendsz.crbenlevő Vili -es faktor mennyiségétől függ, de általában kiváló eredményt kapunk, ha a polielcktrolitot körülbelül I-10 súly% koncentrációban használjuk, előnyösen körülbelül 5-6 súly%-ban. A Villás faktor adszorpciós lépésében a sejttenyérzet rendszer pll-ját előnyösen körülbelül 5,5 —6,5 közé állítjuk. Az adszorbeált Vlll-as faktort a felülúszóból szűréssel, centrifugálással és hasonló elválasztási eljárással nyerhetjük ki. A Vlll-as faktort a felülúszóból szűréssel, centrifugálással és hasonló elválasztási eljárással nyerhetjük ki. A Vlll-as faktor fehérjének a leoldását körülbelül 1—3 m nátrium-kloriddal végezhetjük, előnyösen körülbelül 1,5-1,8 m nátrium-kloriddal és más ilyen fiziológiailag elfogadható oldattal. A találmány szerinti eljárás másik, az albuminnak scjltenyészct rendszerekből való elválasztását bemutató példájában a polielektrolit előnyösen hasonló a fentiekben a Vlll-as faktorra leírt anyaghoz, azzal a kivétellel, hogy a függő funkciós csoportok mennyisége körülbelül 90 100 mól% között van és a megmaradó szabad karboxii- vagy anhidrid csoportok lehetnek blokkoltak vagy blokkolás nélküliek. Az ebben a bemutató példában szereplő elválasztási eljárásban használt polielektrolit koncentrációja részben a kezelt sejttenyészet rendszerben levő albumin mennyiségéiül függ, de általában kiváló eredményt kapunk ha a használt polielektrolit koncentrációja körülbelül 0.0! -20 súly%. Az albumin adszorpciós lépés során a sejt tenyészet rendszer pH-ját előnyösen körülbelül 6,5 7,5 közé állítjuk. Az adszorbeált albumin kinyerését a felülúszóból valamint az albumin leoldását az adszorbcnsről a Vlíl-as faktorra leírt eljárással hasonló módon végezhetjük. A leoldási lépés során a pll-t előnyösen körülbelül 3,5—4,5 közé állítjuk és körülbelül 0,01 0,1 mólos nátrium-kloriddal végezzük az. cluálást. A következő részletes példák tovább jellemzik a találmány szerinti eljárást, de azt meg kell érteni, hogy a találmány nem korlátozódik ezekre a speciális példákra. 1. példa Ez a példa a humán Vlll-as plazma-faktornak baktérium- és élesztő-tenyészetekből polielektrolit kopolimeres adszorpcióval való elválasztását mutatja be, Escherichia coli baktérium és Sacharomyces cerevisiae élesztősejteket tenyésztünk és dolgozunk fel az alábbi körülmények között. A Tenyésztő táptalaj E. coli-hoz: Luria Broth 17.5 gnátrium-klorid 17.5 g élesztő-kivonat (Difco) 35,0 g Bacto-tryptone (Difco) 4,2 ml 2 N nátrium-hidroxid 3500 ml ionmentes desztillált víz A fenti anyagokat keveréssel visszük oldatba, majd az oldatot 30 percig autoklávozzuk. E. coli törzs: K12 Tenyésztés: 48 óra 37°C-on a fenti táptalajban. Indukáló koncentráció: 5 ml-es ferde agaron nőtt tenyészet szuszpendálva 3500 ml fenti táptalajban g Végső koncentráció: 5x10 sejt/ml A sejteket 3500/perc fordulatszámmal 10 percig centrifugáljuk hűtött Beckman J2-21 centrifugában. Kinyert sejtmentes felülúszó: 3000 ml Kinyert sejtek mennyisége: 14,44 g Sejtek roncsolása 8 g sejtet roncsolunk négyszer French Bress berendezésben 82,740 Kilopascallal B Élesztő tenyésztő táptalaj YEPD 1. oldat 25 g élesztő-kivonat (Difco) 70 g Bacto-pepton (Difco) 3150 ml ionmentes desztillált víz 2. oldat 70 g glükóz 350 ml ionmentes desztillált víz, 3. oldat 3,5 g ammónium-szulfát 17.5 ml ionmentes desztillált víz Az 1 és 2 oldatot külön autoklávozzuk. Az 1 és 2 oldatot az autoklávozás után még melegen, de már csökkentett hőmérsékleten a következő arányban keverjük a 3. oldattal: f 450 ml 1. oldat . 6 x j 50 ml 2. oldat t 2,5 ml 3. oldat Élesztő törzs: M 25 Tenyésztés: 48 órán át 30°C-on a fenti táptalajban, rázatással. Kiinduló koncentráció: 1,5 ml-es ferde agaron nőtt tenyészet szuszpendálva 3500 ml fenti táptalajban. g Végkoncentráció: 5x 10V sejt/ml A sejteket 3500/perc fordulatszámmal 10 percig centrifugáljuk Beckman J2-2I centrifugában. Kinyert sejtmentes felülúszó 2500 ml. Kinyert sejtek mennyisége: 28,0 g Sejtek roncsolása 8 g sejtet roncsolunk négyszer French Press berendezésben 103,425 kilopascallal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
