196832. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazma-proteinek elválasztására sejttenyészetekből
1 2 A kapott rekombináns plazmidot használjuk a baktérium-sejt transzformálására, majd hagyjuk hogy replikálódjon, a baktériumot megfelelő táptalajon növesztve. A kívánt transzforrmánsokat ezután a fcnotípusos tulajdonságok alapján izoláljuk, például bizonyos növekedés-gátló anyagok, úgymint antibiotikumok, elleni rezisztencia, vagy különböző morfológiai különbségek alapján. A génsebészet fenti, általános elveinek emlős plazmafehérjék mikroorganizmusokban történő kifejeződésére való alkalmazását a gyakorlatban a humánszérum-albuminnak (HSA) rekonbináns baktériummal történő előállításával illusztráljuk (Lawin et al. Nucleic Acids Res. 9 (22), 6103—6114 /1981/). A leírt eljárás szerint ismert módszerekkel a HSA gén érett fehérje-kódoló szakaszát tartalmazó pHSAl rekombináns plazmidot készítenek. Ezt a rekombináns plazmid-vektort tartalmazó baktériumok HSA fehérjét termelnek az E. coli trp promoter-operátor szabályozása szerint, mely az E. coli kromoszómának az a szakasza, mely a triptofán szintézisében résztvevő enzimeket kódolja. A pHSAl plazmid előállítása céljából a HSA mRNS teljes fehérje-kódoló szakaszából és 3 nent transzlálódó részét tartalmazó szakaszából cDNS kiónokat izolálunk. Az első cDNS kiónokat úgy állítottuk elő, hogy humán máj-RNS-en indítottuk meg a DNS szintézist megfelelő oligo-deoxitimidilát nevezetesen oligo (dT)p_jg használatával (Collaborative Research). Ezeket a cDNS kiónokat használjuk arra, hogy pBR322 plazmid szakaszait a pLelF A25 plazmidból származó, mesterséges tompavégű Xbal hasítási helyben végződő E. coli trp bevezető peptid, promoter operátor és riboszóma-kötő helyét tartalmazó 300 bázis pár hosszúságú fragmentet tartalmazó vektor fragmentből rekombináns plazmidot készítsünk. A pLelF A25 plazmid irányítja a humán leukocita interferon A (1FNC'2) kifejeződését (Goeddel et al. Nature 287, 411-416 /1980/). Az E. coli promoter-operátor régiót közük a 3 020 528 számú Ger. Offen-ben, Japan Kokai Tokkyo Koho 8061- bcn, EPA 36 776—ban, valamint Russel és Bennet (Gene 17 (1), 9-18 /1982/). A pBR322 plazmid jól jellemzett kereskedelmi forgalomban levő 2,6 x 106 molekulasúlyú plazmid. Több mint tíz enzimnek van egy hasítási helye rajta, ideértve az ampicillin rezisztencia (Ap) génen belüli egyetlen PstI restrikciós helyet, valamint a tetraciklin rezisztencia (Te) génen belüli egyetlen EcoRI, HindlII, BamHI és Sail restrikciós endonukleáz hasítási helyet. Ezeknek az egyetlen restrikciós helyeknek a jelentőségét a PstI restrikciós endonukleáz által felismert egyetlen hellyel mutatjuk be. A PstI az 5’CTGCA 63’ szakasz ötödik és hatodik bázisa között hasít. Mivel a PBR-322-ben csak egyetlen Pst hely van, a hasítás eredményeképpen rövid egyszálú 3’ végeket tartalmazó lineáris plazmidot kapunk. A plazmid további leírását Bolivár és munkatársai közlik (Gene, 2, 95 /1977/), restrikciós endonukleáz térképét Sutcliff közli (Nucleic Acids Res., I 2721-2728 /1978/). A B-12014 NRRL számú E. coli RRI törzsből nyerhetjük ki, mely tenyészet a Northern Regional Research Laboratory, U. S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA állandó gyűjteményében van letétbe helyezve. Számos F-47, F-61 és B-44 jelű átlapoló oligonukleotid fragmentet választottak a fent említett kutatók szerint a cDNS kiónokból hogy megfelelő DNS szakaszokat készítsenek a fenti módosított pBR322 vektor-fragmentbe való beillesztésre. A teljes pHSAl rekombináns plazmid így nemcsak a plazmid pBR322 részének Te és Ap génjeit tartalmazza, valamint az E. coli trp promoter-operátor szakaszát, hanem az F-47, F-61 és B-44 cDNS klónokból származó HSA kódoló szakaszokat is. A pHSAl rekombináns plazmidban kiválasztott más restrikciós endonukleáz helyek az egyetlen EcoRI és BglII restrikciós hely, valmaint két Xbal és PstI restrikciós hely. A módosított pHSAl plazmidot használtuk az E. coli K-12 294 törzs transzformálására. A pHSAl plazmidot tartalmazó E. coli-t triptofán-mentes minimál táptalajon növesztve, a sejtek HSA antitestekkel specifikusan reagáló fehérjét termelnek, mely SDS poliakrilamid elektroforézisnél együtt vándorol a HSA-val. Más plazmid-vektorokat hasonlóképpen készíthetünk különböző plazma-fehérjéknek mikrobiális sejttenyészetben való ilyenfajta kifejeződésére, ha a megfelelő genetikus, információt építjük be a rekombináns plazmidba. így a kívánt fehérje aminosav-sorrendjét kódoló DNS-t, a genetikai kódnak megfelelő kódonok kiválasztásával állíthatjuk elő. A megtervezett gént ezután beillesztjük egy expressziós plazmidba, hogy a fenti HSA példával analóg módon szaporodjon a gazda mikroorganizmusban. A fentiekben HSA termelésre leírt E. coli K-12 gazda-vektor rendszertől eltérő, emlős fehéijék génsebészeti előállítására alkalmas mikrobiális gazdavektor rendszerekre jellemző példák a következők: Más Escherichia törzsek és niás Enterobaktériuniok, úgymint Salmonella, Bacillus fajok, úgymint B. subtilis, B. megaterium B. cereus, ß. pumilus, B. amyloliguefaciens, B. licheniformis, és B. gübigii, Streptomyces fajok, úgymint S. coelicolor, S. fradiae, S. parvulus, S. lividans, S. griseus, S. albus, és S. phaeochromogenes, Staphyloccus fajok, úgymint S. aureus, és Élesztők, úgymint Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carslbergensis, és Schizosaccharomyes pombe. Az nyilvánvaló, hogy gyakorlatilag bármely DNS darabot hozzáépíthetünk riboszómáUs vagy bármely olyan génhez, mely be tud épülni a gazdaszervezet kromoszómájába. Axel és munkatársai kimutatták, hogy tenyésztett emlős sejtek képesek felvenni és kifejezni idegen DNS-t (Science, 209, 1414-1422 /1989/). Ezek a technikák hasznosak olyan gének izolálásában, melyek nem fejeződnek ki E. coli-ban vagy más mikrobiális gazdában, de megkülönböztethető fenotípusos tulajdonsággal rendelkeznek emlős vagy más gerinces szervezetek sejtjeiben. A transzformált DNS így beépül a kromoszómába. A transzformáló DNS-t simian virus 40 (SV40) vektorral is bejuttathatjuk a tenyésztett sejtekbe. Az SV40 vírust használták vektorként arra a célra, hogy számos prokrióta gént klónozzanak emlős sejtekben (Mulligan and Berg, Science 209, 1422- 1427 11980/). Tulajdonképpen a rekombináns DNS módszer első bemutatkozása az E. coli galaktóz operonjának beépítése volt SV40-be (Jackson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69 2904-2909 /1972/). 96 832 c. W' 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
