196805. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-(1H-tetrazol-5-il)-tieno [2,3-d] pirimidin-4(3H)-on származékok előállítására
3 196 805 4 a diagnózistól, a tünetek komolyságától és a konkrét vegyülettől függően. Az (I) általános képletű vegyületek antiallergiás hatását az IgE médiáit patkányos passzív bőr-anaphylaxis (IgE mediated rat Passive Cutaneous Anaphylaxis, PCA) vizsgálattal határozzuk meg. Ez a vizsgálat az egyik legjobb állati vizsgálati modell az antiallergiás aktivitás kvalitatív meghatározása céljából. I.p. beadva ebben a vizsgálatban a d-nátriumkróm-glikolát aktív, orálisan beadva nem A módszert az alábbiakban ismertetjük: PCA vizsgálati módszer 1. Antiszérumok: az irodalomban különféle standard módszerek ismeretesek tojásfeliérjc-albuminhoz kapcsolódó, reakciót kiváltó (reaginic) antiszérumok előállítására, Hooded Lister vagy Brown Norway felnőtt patkányokban. 2. Állatok: a vizsgálatban antiszérum-recipiensként felnőtt hím Sprague-Dawley vagy nőstény Wistar Kyoto patkányokat használunk. Az állatokat 5—14 napig akklimatizáljuk, ezalatt tetszés szerint kapnak enni és inni. 3. Érzékenyítés: a recipiens-patkányokat passzív módon érzékenyítjük a hígított antiszérum 100 mikroliteres intradermális injekciójával (egy injekció a hát mindegyik oldalába). Az érzékenyítést az antigén immunpróba előtt 48—72 órával végezzük. 4. Á vizsgálandó vegyület beadása: 4-8 állatot használunk minden hígításnál. A vegyületeket valamilyen megfelelő hígítóoldatban homogenizáljuk és intraperitoneális beadás esetén az immunpróba előtt 5 perccel beadjuk 60 mg/kg dózisban; orális beadás esetén az immunpróba előtt 360 perccel adjuk be, 100 mg/kg dózisban. 5. Antigén immunpróba és a reakció kiértékelése: sóoldatban tojásfehérje-albumint (0,1-1,0 mg, 0,5 %os Evan’s Blue Dye oldatban) adunk be minden patkánynak, intravénásán. Harminc perccel később a kialakult PCA reakciókat a bőrfelületen megjelenő foltok átlagos átmérőjével és színcrősségével mérjük. A vizsgált vegyületek hatását a kontrol reakciókhoz viszonyított százalékos gátlással fejezzük ki. A fenti módszerrel vizsgálva a találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek intraperitoneálisan és orálisan egyaránt hatékonyaknak bizonyultak. Az alábbi táblázat adatai néhány találmány szerinti vegyüietet hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmény alkalmazásával elérhető hatást mutatják,a szert 5 perccel az immunpróba előtt, orálisan alkalmaztuk, az adatok a kontroll reakcióhoz viszonyított %-os gátlás mértékét adják. A készítmény hatóanyaga (példa szerinti vegyület) A PCA tesztben elért gátlás (%) 6 100 7 93 8 84 9 100 10 81 A készítmény hatóanyaga A PCA tesztben (példa szerinti vegyület) elért gátlás (%) 11 94 12 92 (nátriumsó) A PCA vizsgálatban mutatott aktivitásukon kívüla szóban forgó vegyületek a hisztaminfclszabadítást is gátolták patkányban, a passzív peritoneális anaphylaxis (PPA) vizsgálatban. A módszert részletesen az alábbiakban írjuk le: PPA vizsgálati módszer 1. Antiszérumok: tojásfehérje-albuminhoz kapcsolódó, reakciót kiváltó (reaginic) antitesteket felnőtt hím B6 D2 F1 egerekben állítunk elő. 2. Állatok: fenolt hím Sprague Dawley patkányokat vagy nőstény Wistar Kyoto patkányokat használunk antitest-recipiensként. Az állatokat 5—14 napig hagyjuk akklimatizálódni, ezalatt tetszés szerint kapnak enni és inni. 3. Érzékenyítés: a recipiens-patkányokat intraperitoneálisan beadott 2 ml-es sóoidatos egér antitojásfehérje-albumin antiszérummal érzékenyítjük.’ Az érzékenyítést 2 órával az antitest-immunpróba előtt végezzük el. 4. A vizsgáladnó vegyület beadása: 5—10 állatot használunk minden hígításnál. A vegyületeket sóoldatban ekvivalens mennyiségű nátrium-hidrogénkarbonáttal homogenizáljuk és 60 jug mennyiséget, aduik be, intraperitoneális beadás esetén 30 másod-. perccel, orális beadás esetén 5—60 perccel az anti-, test immunpróba előtt. 5. Antigén immun próba és a vizsgálat kiértékelése:. 5 ml módosított Tyrode-féle oldatban 2 mg tojásfehérje-albumint adunk be intraperitoneális injekcióban és 5 perccel később az állatokat leöljük, összegyűjtjük a peritoneális shock-folyadékokat és centrifugalással osztályozzuk. A mintákból perklórsavas kicsapással, majd centrifugálással eltávolítjuk a proteint. Ezután meghatározzuk a minták hisztamintartilmát automata fluorometriás méréssel. A kezelt állatokból származó peritoneális shock-folyadékok' hisztaminszintjeit összehasonlítjuk a kontroll állatok-' ból származó shock folyadékok hisztaminszintjeivel. A vegyület hatását a hisztamin-felszabadulás százalékos gátlásában fejezzük ki. A találmány szerinti (1) általános képletű vegyületek jó anti-allergiás hatásúak: ezen belül előnyösek azok a vegyületek, ahol R’jelentése propil-csoport, R és R' jelentése metil-csoport; vagy ahol R és Rf jelentése együttesen tetrametilén-csoport. Az alábbi példák a találmány szerinti eljárást szemléltetik anélkül, hogy igényünket ezekre a példákra korlátoznánk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
