196792. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3,3-diszubsztituált indolin-származékok és az azokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 Biokémiai kísérleti módszerek Patkány agy kéregs/elc tériek acetilkolin (ACh) kibocsátására a találmány szerinti eljárással előállított vegyulctek által kirejtett hatást vizsgáljuk a Mulder és munkatársai által a Brain Res., 70. 372 (1974) szakirodalmi helyen leírt, illetve a Nickolson és munkatársai által a Naunyn Schmied. Arch. Pharmacol. 319, 48 (1982) szakirodalmi helyen ismertetett módon módosított, úgynevezett kéregszeietszuperfúziós módszert használva. Kísérleti állatként 175 -200 g tömegű, hím Wistar-patkányokat (Charles River) használunk. A kísérlet megkezdése előtt legalább 7 napig olyan állatházban tartjuk az állatokat, amelyben 1 2—12 órás világosság/ sötétség ciklust (a megvilágítást 6 órakor bekapcsolva és 18 órakor kikapcsolva) állítunk be. Az. állatoknak tetszés szerint áll rendelkezésükre szokásos összetételű patkányláp (Purina) és ionmentes víz. A patkányokat dekapitáljuk és az agyukat azonnal kimetsszük. A parietálís kéregből 0,3 mm vastag kéregszeleteket készítünk manuálisan, mélyített „Ludtc” márkanemű metszetvágót használva és ezután ezt 0,25.0.25 mni-es négyzetekre vágjuk. A mintegy 100 mg nedves tömegű kércgszcletckct 10 ml Krebs-Ringer (KR) táptalajban inkubáljuk. Ez a táptalaj 116 millimó! nátrium-ídoridot, 3 millimól kálium-kloridot. 1,3 millimól kalcium-kloridot, 1,2 millimól magnezit!m-kloridot, 1,2 millimérl kálium-dihidrogén-foszfátot, 1,2 millimól nátrium-szulfátot, 25 millimól nátrium-hidrogén-karhonátot cs 11 tnillimó! glükózt tartalmaz. A táptalajhoz, előzetesen 60 u,Ci 31l-koltnt (fajlagos aktivitása közel 35 Ci/millimól. NEN) cs 10 nanomól nem jelzett kolint adunk, így a kolirt végső koncentrációja 10 \ Az inkubálást 3Ó percen át 37°C-on végezzük 95 térfogat% oxigént és 5 térfogat% szén-dioxidot tartalmazó gázelegy állandó átáramoltatása mellett, ilyen körülmények között a felvett radioaktív kolin egy részét radioaktív ACh-ná alakítják a szinaptikus vczikuluinokban tárolt és a nagy káliumion-tartalmú közeg általi deporalizálódás következtében felszabadult kolinerg idegvégzödesek. Az ACh készlet jelzése után a kéregszelcteket ncm-rádioaktív KR táptalajjal háromszor mossuk, majd a hatóanyagoknak az. ACh kibocsátására kifejtett Itatását vizsgálandó szuperfúziós készülékbe helyezzük. A szuperfúziós berendezés 10 darab, 5 mm átmérőjű tcrmosztált üvegosz.lophól áll, mindegyik oszlop el van látva GF/F üvegszálas szűrőkkel a kéregszeletek elhelyezése (közel 10 mg szövet jut egy oszlopba) céljából. A szuperfuziót 0,3 ml/ perc sebességgel áramoltatott, 10*5 mól hcntikolinium-3 (HC-3) anyagot tartalmazó KR-táptalajjal végezzük. A 1JC-3 megakadályozza a kolinfelvételt, amely foszfolipidekből és a felszabadult ACh-ból (amely nem jelzett ACh-vá alakulna át, és amelynek kibocsátása előnyben részesülne az előzetesen előállított, jelzett ACh-hoz képest) a szuperfuzió során szabadul fel. A táplalajt 25 csatornás perisztaltikus szivattyúval (Isinatec, Brinkman) mozgatjuk és a szuperfúziós oszlopokba való belépése előtt 37cC- ra felmelegítjük tcrmosztált, rozsdamentes acélból készült csőkígyóban. Mindegyik oszlopot ellátjuk olyan négyutas os/ítószcleppel (Beckmann Instruments), amely lehetővé teszi a gyors váltást alacsony káliumioiilartalinú KR-táptalajról magas kálium-iontartalmú KR-táptalajra, továbbá két olyan 10 csatornás, háromutas szeleppel, amelyek lehetővé teszik a váltást hatóanyagmentesről hatóanyagot tartalmazó, alacsony és magas káliumiontartalmü KR-táptalajokra. A nem-specifikusan kötött radioaktivitás 15 percen át tartó kimosását követően megkezdjük 4 perces frakciók gyűjtését. Három négyperces frakció eltelte után a KR-táptalajl olyan KR-táptalajra cseréljük, amelyben a kálium-klorid koncentrációját 25 millimólra növeltük (magas káliumiontartalmü KR-táptalaj, SÍ). Ennek a táptalajnak a hatására történő, a depolarizáció kiváltásával stimulált kibocsátás 4 percen át tart. A hatóanyagmentes alacsony és magas káliumiontartalmü közeget ezután hatóanyagvagy hordozóanyagtartalnuí, alacsony és magas káliumiontartalmü KR-közeggel valljuk fel és a szuperlViziót folytatjuk az alacsony káliumiontartalmü KR-táptalaj esetén három négyperces frakciót, magas kálium iontartalmü KR-táptalaj (S2) esetén 1 négyperces frakciót és ismét alacsony káliumiontartalmú Kr-táptalaj esetén 2 ncgypcrces frakciót szedve. A hatóanyagot 0,9% vizes nátrium-klorid-oldattal készült, kívánt koncentrációjú oldatainak alacsony vagy a magas káliumiontartalmü KR-táptalajjal végzett 100-szoros hígítása útján hasznosítjuk. Mindegyik szuperfúziós frakciót folyadékcintillációs szátnlálóüvegcsébe gyűjtjük. A szuperfuziót után a kéregszelcteket eltávolítjuk a szuperfúziós oszlopokból és 1,0 ml 0.1 N sósavoldattal extraháljuk A szuperfúziós frakciókhoz és az extraktumokhoz 12-12 ml Liquiscint márkanevű szcintillációs számlálófolyadékot (NEN) adunk, majd a mintákat Packard Tricarb Liquid Scintillation Counter elnevezésű szcintillációs számlálóban vizsgáljuk. Nem hajtunk végre korrekciót a kvcncselés miatt. Az S2/S1 arány (olyan kontrolihoz hasonlítva, amelynél S2 időszakban nincs hatóanyag) fedezi ki a hatóanyagnak azt a képességét, hogy ingerrel kiváltott acetilkolin felszabadítást növeli vagy csökkenti. Az in vitro ACh felszabadítási adatokat a 2. táblázatban foglaljuk össze. 2. Táblázat_ In vitro patkány agyszövetében inger-stimulált A példa ACh-felszabadítás2%JO'6 io‘os növekedése lO^ÍM) l — — +349* 2 + 11 + 6 1X +265x 3 +06 +88x +238* 4 + 94x +457x +433x 5 + 14 + 78x +355x 6 + 195x +313x _ 7-0 + 30x 8-+ 37x +429x 9 0 + 54x +275X 13 + 01 + 47x _ 14 + 34x +323X _ 15 + 34x +210x _ 16 — + 12 + 97x 17 + 20 +2I8X _ 18 + 16x + 49x _ 196 79 5 10 15 20 25 30 35 4C 45 5C 55 60 9
