196625. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis-b vírus vakcina előállítására
1 196 625 2 A találmány tárgya eljárás a hepatitis B felületi antigénjét az élesztőgombában kódoló gén klónozására rckombináns dczo.xiribonukleinsav (a következőkben: DNS) eljárás segítségével, valamint az élesztőgomba által termelt antigénből származó hepatitis B vírus-vakcina előállítására. A hepatitis B vírus (a következőkben: ÍIBV) által előidézett fertőzés széles keretek között felmerülő, súlyos egészségügyi probléma. A fertőzés akut vagy krónikus fázisokban nyilvánulhat meg. Az Egyesült Államokban az akut hepatitises megbetegedések számát évente legalább százezerre becsülik, és a halálozási arány egy-két százalék. Az Egyesült Államokban az egészséges felnőtt egyének körében a HBV krónikus hordozóinak a gyakorisága a kortól és a társadalmi osztálytól függően 0,l és 1 százalék között változik. Dél-Amcrikában a krónikus hordozók gyakorisága körülbelül 1-3 százalék; a Szovjetunióban és Dél-Európában körülbelül 3—6 százalék; végül Ázsiában és Afrikában több, mint 10 százalék. A fejlett országokban feltétlenül szükség vau vakcinára olyan egyének számára, akiknek fertőzési veszélyeztetettsége nagy, így például az egészségügyi intézményekben levő betegek és olyan intézmények személyi állománya számára, ahol vérrel dolgoznak; a katonai személyi állomány számára; krónikus hordozók házastársai számára; olyan területre utazó egyének számára, ahol a HBV járványok gyakorisága nagy; krónikus hordozóktól származó újszülöttek számára; valamint homoszexuális egyének, prostituáltak és kábítószerélvezők számára. A harmadik világ országaiban olcsó vakcinára van szükség, hogy tömeges immunizálást lehessen végezni. A tömeges immunizálás programja végeredményben nemcsak az akut hepatitises kóresetek gyakoriságát cs a krónikus hordozók számát érinti, hanem a krónikus, aktív hepatitis és a májkarcinóma következtében bekövetkező halandóságot és halálozási arányszámot is csökkentheti. A Dane-részecskékről úgy vélik, hogy hepatitisvirionok: e részecskék fertőzött egyénekből elkülöníthetők, és átmérőjük körülbelül 42 nanométer. Mindegyik részecskét burok veszi körül, mely hepatitis B felületi antigént (a következőkben: HBsAg), kapszidot (a következőkben: HBcAg), endogén polimerázt és egy DNS-genomot tartalmaz. A genom cirkuláris, ketlősszálú, és egy körülbelül 200 bázisból álló, egyszálú szakaszt tartalmaz. Az egyszáhi terület in vitro betölthető endogén polimeráz hatására. A hosszabbik szál körülbelül 3200 bázist tartalmaz. Mindeddig nehézséget okozott a HBV vakcinák előállítása, mert nehézségeket okozott a vírusnak szövetkultúrában való tenyésztése, s azért is, mert az egyetlen ismert vírusgazda az ember. Kis mennyiségű', autentikus HBV antigént fertőzött egyénekből különítettek el. Közlés jelent meg egy újonnan kidolgozott hepatitis B vakcina klinikai vizsgálatáról is (F-D-C Reports, 1982. július 19, 3—4. old.). A 72318 cs 73657 számú közzétett európai szabadami bejelentések és a 7726860 számú magyar szabadalmi közzétételi irat polipcptidek kódolására képes plazmidokat és szekvenciákat írnak le, amelyek alkalmasak immunhatás kiváltására hepatitis B vírus fertőzéseknél. Valenzuela és munkatársai [Nature, 298, 347 (1982)] közölték HbsAg szintézisét élesztőgombában egy olyan vektor érvényesülése (expressziója) útján, amelyben a HBsAg-t kódoló szekvencia egy 835 bp értékű Taql-Hpai fragmentum, és a promoter az élesztőgomba alkohol-dehidrogenáz I promoter. E közlemény előtt számos, régebbi, rövid közlésben számoltak be erre vonatkozó kutatásokról. Valenzuela és munkatársai [Arch. Biol. Med. Exp. (Chile), 14, 21 (1981) ] leírták egy olyan DNS fragmentumnak élesztőgombában való érvényesülését, amelynek egyik szekvenciája az élesztő alkohol-dehidrogenáz promoter-szakaszához kapcsolódó HbsAg-hoz hasonló fehérjét kódol; egy másik közlés [Scrip. 616. szám, 14 (1981. augusztus 12.)] szerint Egyesült Államok-beli kutatóknak egy csoportja közöttük P. Valenzuela és W. .1. Rutter — bejelentették, hogy létrehozták élesztőgombában ,,a hepatitis B vírust körülvevő fehérjeburkolatot”; Zuckerman [Nature, 295, 98 (1982) ] közölte, hogy W. .1. Rutter élesztőgombasejtekben glikozilezelt HBsAg-l juttatott érvényesülésre. A HBV antigén komponenseit — így a HBsAg-t is - baktériumokban állították elő, olyan rekombináns DNS-molekula inszertálása (beépítése) után, amely az antigént kódoló gént tartalmazott. Burrell és munkatársai [Nature, 279, 43 (1979)] közölték, hogy az E. coli HB101 törzsben sikerült érvényesíteniük a pBR322 plazmidban klónozott HBV DNS-szekvcnciákat. Murray és munkatársai (13 828 számú közzétett európai szabadalmi bejelentés) olyan rekombináns vektor előállítását közölték, amely az E. coli HB101 törzsben HBV antigének így a HBsAg - kódolására képes. A vektort Dane-DNS részecskékből és pBR322 plazmídból állították elő. A szerzők megállapították, hogy alkalmas hordozó szervezetek más baktériumok, élesztők és egyéb gombák, valamint állati és növényi sejtek, és más gazdaszervezetek, jóllehet az E. coli az egyetlen igazolt gazdaszervezet. Charnay és munkatársai [Nature, 286, 893 (1980)] olyan bakteriofág felépítését írták le, amely a 0-galaktozidáz gén és a HBsAg szerkezeti gén fúzióját (egyesítését) végzi. Ez a bakteriofág egy olyan, fúziós fehérje szintézisét irányítja, amely mind a HBsAg, mind a /3-gaiaktozidáz antigén-determinánsait magában foglalja. Tiollais és munkatársai (2 034 323 számú nagybritanniai szabadalmi leírás) HBV DNS-t tartalmazó colifág előállítását közölték. Az egyesített (fuzionált) fág-HBV DNS-t E. coli C600 törzsben transzformációra használták fel. A 2 070 621 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban olyan plazmidot írtak le, amely a HBsAg gén egy részét és a promoter!, valamint a laktóz-operon Z génjét tartalmazza, és E. coli-ban klónozható. Rutter és munkatársai (20 251 számú közzétett európai szabadalmi bejelentés) rekombináns vektorokat írtak le, közöltük egy olyan rckombináns vektort, amely a pBR322 plazmidot és a HBV DNS Bamlll fragmentumait tartalmazza, s amely E. coli transzformálására használható. Egy másik vektor, mely a HBV DNS egyik BamHI fragmentumát és a triptofán-ope-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
