196625. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis-b vírus vakcina előállítására
3 196 625 4 ron egy részletét tartalmazta, az E. coli HB10J törzsben való érvényesítésre alkalmazták. Edman és munkatársai (Nature, 291, 503 (1981)] olyan plazmidok felépítését írták le, amelyek az E. coli-ban HBcAg és egy 0-laktamáz-HBsAg fúziós fehérje szintézisét a triptofán-operon szabályzó szakaszának ellenőrzése alatt irányítják. További közlemények jelentek meg IIBV DNS baktériumokba történő inszertálásáról, ilyenek: Charnay és munkatársai [Prog. Med. Virol., 27, 88 (1981)]: Mackay és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sei. U. S., 78, 4510 (1981)|; Eritsch és munkatársai [C. R. Acad. Sei., 287, 1453 (1978}|; 2 034 323 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás (Derwent No. 46874c); valamint Pasek és munkatársai [Nature, 2<52, 575(1979)]. A HBV DNS-t emlőssejtekben is klónozták. E kísérleteket emberből, egérből és emberi be pa to ma -sejt - törzsekből származó sejteken végezték. így például Dubois és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sei. U. S., 77, 4549 (1980)] közölték HBV gei)omot tartalmazó plazmiddal rendelkező egérsejtek transzformálását és a HBsAg érvényesülését; Hirschman és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sei. U. S„ 77, 5507 (1980)] leírták HBV-s/.crű részecskék termelését IIBV DNS-val transzformált IieLa sejtek segítségével. Funakoshi és munkatársai [Prog. Med. Virol., 27, 163 (1981)] eljárásokat írtak le HBV vakcina előállítására embervérből származó HBsÁg alkalmazásával. Maupas és munkatársai [Prog. Med. Virol., 27, 185 (1981)] is közölték HBV vakcina előállítását. A Funakoshi és munkatársai által előállított vakcina 40 pg tisztított, formaiinnal kezelt HßsAg-t, foszfátot, nátrium-kloridot, 20 mg mannitot és adjuvánsként 0,1 százalék alumínium-hidroxidot tartalmaz. Maupas és munkatársai (lásd a fentebb idézett közleményt) közölték, hogy a vakcina egy adagja 1 ml tisztított, formaiinnal kezelt HBsAg, amely 2 lOpg/ml fehérjét (Lowry-féle módszer) és 0,1 százalék alumínium-hidroxidot tartalmaz. Maupas és munkatársai vizsgálatai során egy hónapos időközökben három befecskendezést végeztek, és ezt egy év múlva megismételték; e szerzők három hónapos időközökbe két koncentrált HBsAg-befecskendez.ést javasoltak. HBV vakcina előállítására további közléseket tettek Maupas és munkatársai, továbbá Funakoshi és munkatársai (Hepatitis B Vaccine 1NSERM Symposium No. 18, 3, illetve 37, illetve 57. old., Kiadó Maupas és Guesry, 1981, Elsevier/North-Holland Biomedical Press). Élesztőgombákat egyes más DNS-szekvcnciák számára is alkalmaztak hordozóként. így például Fraser és munkatársai (2 068 969 számú nagy-birtanniai szabadalmi leírás) leírták csirke-ovalbumin előállítását élesztőgombában; közölték továbbá [Scrip. 640, 11 (1981. november 4.)], hogy egy interferon-típust állítanak elő élesztőben. A 11 562 szánul európai szabadalmi leírásban (Derwent No. 38762C) olyan hibrid élesztő-plazmidokat írtak le, amelyk a 2 p plazmidban ura3 élesztőgomba-gént tartalmaznak. A találmány tárgya eljárás olyan rekombináns DNS molekula előállítására, amely a HBsAg kódolására képes, nuklcotid-szekvcnciát és a HBsAg-szckvcnciának Saccharomyces ccrcvisiae élesztőgombában való transzkripciójának átírásának kiváltására képes, az élesztőgomba arg 3 génjéből származó, szabályzó szakaszt foglal magában. E molekula otyan vektorokat tartalmaz, amelyekben ínszertálva van a HBsAgszekvencia és a szabályzó szakasz, s amely vektorok alkalmazhatók egy élesztőgomba-vektor előállítására, vagy a HBsAg és a szabályzó szakaszok megtartására. A találmány vonatkozik továbbá olyan mikroorganizmusokra is, így például a találmány szerinti plazmidokkal transzformált mikroorganizmusokra, amelyek e rekombináns DNS-molekulát tartalmazzák. A találmány továbbá olyan plazmidra vonatkozik, amely arg 3 szabályzó szakaszt és egy ehhez közel eső, restrikciós helyet tartalmaz a kódoló szekvencia, így a HBsAg szekvencia inszertálására (beépítésére), úgy, hogy a kódoló szekvencia érvényesülésével szintetizált fehérje idegen aminosav«so por toktól mentes marad. A találmány olyan vakcina előállítására is vonatkozik, amely elősegíti emberekben a HBV-fertőzések elleni vedelem kifejlődését és a találmány szerint készített HBsAg hatásos mennyiségét tartalmazza alkalmas hordozóanyag kíséretében. A találmány végül a rekombináns DNS-molekula és e molekulákat tartalmazó mikroorganizmusok előállítására, valamint a HBsAg és a llBsAg-l tartalmazó vakcina előállítására is kiterjed. Az 1. ábra a pRIT10601 restrikciós endonukleázzal való hasításának képét mutatja. A 2. ábra a pRlT10616 restrikciós endonukleázzal való hasításának képét mutatja. A 3. ábra a pMC200 restrikciós endonukleázzal való hasításának képét mutatja. A 4. ábra a PMC200-ba inszertált 3300 bp HindlII élesztőgomba-DNS egyik részletének nukleotid-szekvenciája, ez a szakasz Hindi-, BglII- és EcoRI-helyeket tartalmaz. Az 5. ábra a pR!T!0671 és pR!T10673 előállításának folyamatát mulatja. A 6. ábra a pRITJ0749 előállításának folyamatát mutatja. A 7. ábra a pRIT10761 és pRIT10764 előállításának folyamatát mutatja. A rekombináns DNS-molekulát úgy állítjuk elő, hogy a HBsAg-ért felelős szerkezeti gént tartalmazó nukleotid-szekvenciát egyesítjük az élesztőgomba arg 3 szabályzó szakaszával, amely közvetlenül irányítani képes a HBsAg-szekvenciának élesztőgombában való transzkripcióját, s így érjük el annak érvényesülését. A „rekombináns DNS-molekulán” egyrészt olyan DNS fragmentumot értünk, amely a HBsAg-t kódoló szekvenciát és a szabályzó szakaszt, továbbá olyan DNS-molekulákat foglal magában, amelyek a plazmidot vagy fág-vektorokat tartalmazzák. A „szabályzó (regulátor) szakaszon” olyan szekvenciát értünk, amely a transzkripcióhoz szükséges promoter szakaszt és más szekvenciákat tartalmaz. Az élesztőgomba arg 3 szabályzó szakasza különösen előnyös, mert egy IIBsAg-t kódoló szekvencia érvényesülésének promoterja. „HBsAg”-on olyan fehérjét értünk, amely szerkezetileg az autentikus HBsAg-val azonos, vagy az autentikus HBsAg-val lényegében azonos antigéndeterminánsokkal rendelkezik, tehát olyan antitestek termelésének serkentésére képes, amelyek az autenti5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
