196624. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Nagy specifikus aktivitású kimopapain előállítására
1 196 624 2 Találmányunk tárgya eljárás nagy tisztaságú, nagy specifikus aktivitású kimopapain előállítására nyers kimopapapinból, gélkromatográfiával. Ismeretes, hogy a kimopapain egy tiolprotcáz, ami a papainnal és a papaya peptidázzal együtt a papaya latex proteolitikus, fehérjebontó komponensét alkotja. A papaya latex egy, a trópusokon élő fa, a Carica papaya még éretlen gyümölcséből nyerhető úgy, hogy a gyümölcsöt több helyen megkarcolják, és a kifolyó tejszerű nedvet felfogják, majd megszállják. A latex legismertebb és legjobban tanulmányozott enzime a papain. Bails és mtsai (Balls, A. K. Lineweaver, H. és Thompson, R. R. /1937/ Science 86, 3794) kristályosították először. Jansen és Balls (Jansen, E. P. és Balls, A. K. /1041/ J. Bioi. Clicm. 127, 459 460) mutálták ki, hogy a papaya latex cxlraktumából a papaint aminóniumszulfátos kicsapással eltávolítva a felülúszóban egy másik tiolproteáz marad. Ezt a viszonylag jól oldódó és pH 2-nél stabilis enzimet nevezték kimopapainnak. Az ammóniumszulfát koncentráció-növelésével ez azenzim is kicsapható. Ez az úgynevezett ,,nyers kimopapain” nem homogén anyag, amint azt gélc|cktroforézisscl és ioncserés kromatográfiáva! kimutatták (Kahn, I. U. és Polgár, L. Biochim. Biophys. Acta 760, j 1983/ 350-356; 0 065 395 lajstromszámú európa szabadalmi leírás). A kimopapaint széles körben használják a klinikai gyakorlatban gerincporckorongsérv kezelésére, mivel megfelelő mennyiségben alkalmazva szelektíven oldja a porckorong nucleus pulposus részét (3.320.131 lajstromszámú USA szabadalmi leírás). A kezelés következtében azonban - a kb. 50 %-os előfordulási gyakoriságú enyhébb mellékhatások mellett — a betegek közel 1 %-ánál veszélyes anafilaxiás tünetek lépnek fel (4.039.682 lajstromszámú USA szabadalmi leírás; Robinson, C. P. Drugs of Today Vök 19, No. 8, /1983/454-460). A már említett 0.065.395 lajstromszámú európai szabadalmi leírás szerint az anafilaktikus mellékreakcióért a heterogén kirpopapain készítmény egyik fehérjekomponcnsc a felelős, amely komponens báriuin-kloriddal csapadékot ad, és ioncserés kromatográfiával eltávolítható. Ez a proteolitikusan inaktív anyag szerintük azzal is jellemezhető, hogy színes, kellemetlen szagú anyag. Találmányunk célja az ismert eljárás hátrányainak kiküszöbölésével olyan megoldás biztosítása, amely egyszerűbb és olcsóbb módon magasabb specifltású kimopapaint eredményez. Találmányunk alapja az a felismerés, hogy a kimopapain mellől a káros, bárium-kloriddal csapadékot adó komponens gélkromatográfiával elválasztható, ami technológiailag egyszerűbb, olcsóbb és legalább tízszer gyorsabb a hagyományos ioncserés kromatográfiáuál. Találmányunk további alapja az a felismerés, hogy a gélkromatográfia sorqn a kimopapain részleges inaktiválódása kivédhető redukálószerek adásával. Találmányunk tárgyq eljárás kimopapain előállítására nyers kímopapainbó) gélkromatográfiával. Ennek értelmében úgy járunk el, hogy a nyers kimopapaint redukálószer jelenlétében vízben vagy pufferben feloldjuk, a tiszta felülúszót gélkromatografáljuk, majd az aktív enzimet tartalmazó frakciókat gyűjtjük és fagyasztva szárítjuk. A nyers kimopapaint célszerűen plI 5 és 7 közötti foszfát vagy acctát pufferben oldjuk, amely redukálószerként ciszteint, merkaptoetanolt vagy nátriunvszulfitot tartalmaz. Kromatográfiás oszlopként célszerűen Sephadex G-50 vagy Sephadcx G-25 oszlopot alkalmazunk, amelyet előzőleg valamilyen puffer vagy sótartalmú oldattal, előnyösen cisztein tartalmú pH 6,5 foszfátpufferrel hoztunk egyensúlyba. A hatásos kromatográfia érdekében az oszlopot úgy választjuk meg, hogy hosszának és átmérőjének aránya 5—50:1, előnyösen 20:1 legyen. A fagyasztást -20 °C és -70 °C között, előnyösen 40 °C-on, a jég eltávolítását vákuumban, 1,333 Pa és 13,33 Pa közölt, előnyösen 6,665 Pa-on végezzük, önmagában ismert módon. A bárium-kloriddal csapadékot adó, kellemetlen szagú anyag az aktív enzimet követő kromatográfiás csúcsban található. A találmányunk szerinti eljárás főbb előnyei a következőkben foglalhatók össze. A káros mclleékreakciókért felelős, bárium-kloriddal csapadékot adó fehérjekomponens gélkromatográfiás eltávolítása olcsóbb, kb. tízszer gyorsabb és kíméletesebb, így ipari méretű megvalósításra is sokkal alkalmasabb, mint az ioncserés kromatográfia. Ez utóbbi kb. 40 órás művelet, amely idő alatt az enzim károsodása elkerülhetetlen. A gélkromatográfia ezzel szemben nem egészen 4 óra alatt megvalósítható, és lehetőséget ad az enzim kémiai úton való védelmének biztosítására is, fiziológiásán nem káros, ionos redukálószerekkel. A gélkromatógráfiás módszerrel — nagyobb elválasztási hatásfoka révén — tisztább terméket kapunk, amely várhatóan jelentős mellékhatás-csökkenést eredményez. A találmányunk szerinti eljárás részleteit az alábbi példákban ismertetjük. 1. példa 2,5 g nyers kimopapaint 135 ml 10 mM ciszteint tartalmazó 3 mM foszfát pufferben (pH 6,5) oldunk. Ha zavaros, centrifugáljuk. 15—30 perc inkubálás után a 135 ml oldatot Sephadex G-25 oszlopon (4X X100 cm) gélkromatografáljuk a következő pufferben: 3 mM foszfát, pH 6,5 1 mM cisztein. Az első csúcs, amit az 1. ábrán A-val jelöltünk, tartalmazza a kimopapaint, kb. 1,3 g-ot. A B csúcs tartalmazza a bárium-kloriddal csapadékot adó, kellemetlen szagú inaktív anyagot. Az A csúcsban levő enzimet sterilen szűrjük és liofilizáljuk. A kimopapain aktivitását minden esetben benziloxi-karbonil—glicin p-nitrofenil észter (ZGN) szubsztráttal, szubsztráttelítésnél mértük (Asbótli, B., Polgár, L. /1977/ Acta Biochim. Biophys. Acad. Sei. Hung. 12, 223-230), a következő reakcióelegyben: 100 ffl 1 mg/ml-cs ZGN acetonitrilbcn oldva. 2,8 ml I mM EDTA-t tartalmazó, 0,1 M pH 5,5 acetát puffer. 100/ul kimopapain. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
