196511. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigénspecifikus sejtek elválasztására és kimutatására
4 196511 5 nem feltétlenül szükséges elvégezni, az eljárás végrehajtható ezen lépés elhagyásával is. A negyedik lépésben - amennyiben az szükséges és a harmadik lépést elvégeztük - az érzékenyitett és már telített felületet a második lépésben leírtakhoz hasonló módon mossuk. Az ötödik lépés lényegében a sejtek specifikus kötése az antigénhez. Ennek során az érzékenyitett és adott estben telitett felületre felvisszük a vizsgálandó, illetve szeparálandó sejtek szuszpenzióját. Amennyiben mikrotitráló lemezt alkalmazunk, a mélyületekre célszerűen a vizsgálandó sejtszuszpenzió 100 /ul-ét visszük fel. A sejtszuszpenzió sejtszáma nem kritikus; célszerű azonban néhányszor 104 - 105 ml'1 koncentrációjú szuszpenzió alkalmazása. Célszerűen a sejtszuszpenziót úgy választjuk meg, hogy a kötődő sejtek megfelelő számban legyenek köthetők az antigénhez, azonban nagy sejtveszteség ne álljon fenn. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös megvalósítása szerint a szuszpenzió készítésére 10% újszülött borjúsavót (Hmán Oltóanyagtermelő Vállalat, Budapest) tartalmazó RPMI-1640 (Gibco-Europe) tápfolyadékot alkalmazunk. Az antigén és sejtszuszpenzió inkubálását célszerűen 37 °C hőmérsékleten és általában 10 perc és félóra közötti ideig, célszerűen 15-20 percig végezzük. Az inkubálás ideje azonban természetesen függ a hőmérséklettől, az antigén és a sejtek minőségétől és a szuszpenzió sejtkoncentrációjától. A hatodik lépésben az antigént és antigénhez kötött sejteket tartalmazó lemezt óvatosan úgy fordítjuk, hogy az antigént és kötött sejteket, továbbá a szuszpenziót tartalmazó oldala lefelé álljon. Amennyiben mikrotitráló lemezt alkalmazunk, a tápfolyadék felületi feszültsége a folyadék kicsurgását megakadályozza a mélyületekból. A hetedik lépésben a kisérletet kiértékeljük. Amennyiben mikrotitráló lemezt alkalmaztunk, a megfordítás után rövid ideig, például 5 percig állni hagyott lemezen, célszerűen mikrotitráló lemezen mikroszkóp alatt, például 160-szoros nagyításnál az egy látótérben látható sejteket megszámoljuk, majd ezt a lemez minden egyes mélyületének 10 különböző látóterében megismételjük, és az így kapott sejtszámot mélyületenként átlagoljuk. Ha az egy látótérre vonatkozó átlagos sejtszámot megszorozzuk azon látóterek számával, amennyivel egy mélyűlet teljes felülete lefedhető (például 160-szoros nagyításnál ez 16), megkapjuk a kitapadó sejtek számát: 10- E X i=l A = ---------------------- N 10 ahol X az egy látótérben számlálható sejtek száma, melyet i = 1-10-ig átlagolunk és szorozzuk N-nel, a mélyűlet területét lefedő látóterek számával, amely A-t, a kitapadó sejtek számát adja. Ugyancsak a találmány tárgya javított eljárás monoklonális antitestet termelő sejtek előállítására, melynek során az immunizált állat lépéből vagy nyirokcsomóiból nyert sejtekből a fenti eljárással izoláljuk a specifikus ellenanyag-termelő sejteket, majd ezeket szelektíven fuzionáljuk tetszőleges tumorsejt-vonallal. Amennyiben a cél az antigén-specifikus sejtek szeparálása, a nem kitapadt sejteket és a táptalajt célszerűen úgy távolitjuk el, hogy a lemezt, célszerűen mikrotitráló lemezt annak lefelé fordított felületén műanyag mikropipetta véggel megérintjük a sejtszuszpenzió nívóját, amely igy a pipettán végigfolyva kicsordul. A kitapadt ellenanyag-termelő sejtek ezután szükség szerint a lemezen továbbtenyészthetők vagy a lemezről eltávolithatók valamely tápfolyadékban történő szuszpendálással. Mint azt mér említettük, a műanyag lemez kialakítása és minősége nem döntő tényező az eljárás során. Célszerű azonban diagnosztikai eljárás esetén mikrotitráló lemezt alkalmazni. A találmány szerinti eljárás alkalmazása sorén nyert összefüggéseket az I. és II. táblázat, valamint a 2. és 3. számú ábra mutatja. Az I. táblázat három, különböző ellenanyag-termelő sejtvonallal nyert adherenciaértéket tüntet fel. A mielin-bázikus proteinnel (MBP) szemben IgG ellenanyagot termelő sejtek 1 Mg antigénnel érzékenyitett lemezhez szignifikánsan magasabb szómban tapadtak, mint az 1 Mg nem antigén fehérjével érzékenyitett lemezhez. A lemezek telitettek voltak, a telítés tojásalbuminnal történt (Ovalbumin, OVA, Sigma). Hasonló jelenséget tapasztaltunk valamennyi, általunk vizsgált ellenanyag-termelő sejtvonal esetében is, amelyek közül további két példát tüntetünk fel, az ÓVA ellen IgE ellenanyagot termelő sejtek kitapadósót, illetve a szuperoxid dizmutáz (SÓD) enzimmel szemben IgG ellenanyagot termelő sejtek adherencióját. A vizsgálatok során 105 sejt/ml koncentrációjú sejtszuszpenziók 100 pl-ét vittük fel az érzékenyitett felületekre. A táblázatban az egy mélyülethez adheráló sejtek számának átlagát és a középérték középhibáját tüntetjük fel. A II. táblázaton ellenanyag-termelő sejtek és ellenanyagot nem termelő sejtek adherencia-értékeit tüntetjük fel. Az első oszlop MBP elleni IgG-t termelő sejtvonal adatait tartalmazza. Ezt a sejtvonalat a MBP ellen ellenanyagot termelő plazmasejt és egy ellenanyagot nem termelő Sp-2- -0-Agl4 jelű egérmielóma sejt fúziójával hoztuk létre. A 2. oszlop adatai egyértelműen mutatják, hogy a nem szekretáló Sp-2-0-Agl4 jelű fúziós partner önmagában specifikus adherencia-jelenséget nem mutat. A BHK elne-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
