196462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás imun interferon előállítására
18 196462 19 trifluor-ecetsav elegyekkel lineáris grádiens szerint végezzük el. A fehérje vagy peptid mintákat lezárt, nitrogénnel öblített, evakuált csövekben, 4% tioglikolsavat tartalmazó állandó forrásban levő sósavban 20-24 órán át hidrolizáljuk. Az amino-analizist a (6) irodalmi helyen leírtak szerint fluor-eszcamin aminosav-analizátorban hajtjuk végre. A karboximetilezett fehérjék szekvencia analiziséhez a (7) irodalmi helyen leírtak szerint ABI (Applied Biosystem Inc.) gázfázisú szekvenciátort (470A) alkalmazunk. A PTH-aminosavak mintáit a (8) irodalmi helyen leírtak szerint ultraszférikus ODS oszlopon fordított-fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával azonosítjuk. Valamennyi tisztítási lépést 4 °C-os hőmérsékleten végezzük el. 25 g fagyasztott sejtet háromszoros mennyiségű (75 ml) 7 mólos guanidin-hidrokloridban szuszpendálunk (pH = 7). Az elegyet 1 órán át keverjük, majd 1 órán keresztül 30000 g sebességgel centrifugáljuk. A felül elhelyezkedő folyadékot tízszeres mennyiségű, Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt konyhasó-oldattal (PBS) vagy 0,15 mólos nátríum-borát-pufferrel (pH = 9,5) hígítjuk, majd 30 percen keresztül 30000 g sebességgel centrifugáljuk. Eljárhatunk oly módon is, hogy 25 g fagyasztott sejtet másfélszeres térfogatú (37,5 ml) 0,15 mólos nátrium-borát-pufferben (pH = 9,5) szuszpendálunk és 1 órán át keverünk. Az elegyet 30- -30 mp-ig 5 ízben szonifikáljuk, majd 30000 g sebességgel 1 órán át centrifugáljuk. A guanidin-hidrokloridos extrakcióból vagy szonifikécióból származó, felül elhelyezkedő folyadékokat forgó rózató gépen 25 ml kovasavval 1 órán át keverjük, majd PBS-el előmossuk. Az elegyet oszlopra visszük fel és az oszlopot összesen 20-30 oszloptérfogatnyi 1 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk. Az oszlopot 0,5 mól tetrametil-ammónium-kloridot tartalmazó 0,01 mólos nátrium-borát-pufferrel (pH = 8) eluáljuk. Az interferont kb. 200 ml oldószerrel eluáljuk és 4 részre osztjuk. Minden részletet PBS-el egyensúlyba hozott monoklónikus anti-test (k 2-11.1) affinitás oszlopra viszünk fel, (4 ml agytérfogat). Az oszlopot 10 oszloptérfogatnyi PBS-pufferrel mossuk, majd 1 mólos guanidin-hidrokloriddal vagy 50%-os etilén-glikollal (amely 1 mól nátrium-kloridot és 20 rnmól nátrium-foszfát puffert /pH = 7,0/ tartalmaz) eluáljuk. Az interferont az első 20 ml-el eluáljuk. Az SDS-PAGE elvégzése Laemmli módszerével történik (9. irodalmi hely). A fehérjét fluoreszcamin analízissel határozzuk meg, referens standardként kristályos marha-szérum-albumint alkalmazunk. Az interferon aktivitást a 10. irodalmi helyen leírt módon, vesicularis stomatitis virus és humán WISH sejtek felhasználásával, a citopatikus hatás inhibiciós assay segítségével határozzuk meg. Az összes interferon titert a részlegesen tisztított humán immun interferon referencia standardhoz viszonyítva, referens egység/ml formájában fejezzük ki. Az extrakciós tisztítási műveleteket a 6. táblázatban foglaljuk össze. Az óssz-kitermelés 25-32% és a tisztítás mértéke 100-769- szoros, az átlagos fajlagos aktivitás 1 x 101 egység/mg. Az rlFN-y össz-kitermelése a guanidines extrakció esetében 3-4-szer nagyobb. A tisztítási műveletek utolsó lépésének SDS-PAGE diagramját az 1. ábrán mutatjuk be. A guanidines extrakcióval tisztított termék kb. 18000 daltonnál (18K rIFN-y) egyetlen sávot mutat, mig a szonifikációs eljárás esetében kb. 15000 daltonnái (15K. rIFN-K) egy fősáv és kb. 17000 daltonnál HA ábra) egy melléksáv jelentkezik. Nem-redukéló gélen a rIFN-y dimerjei és oligomerjei is képződnek (1B ábra). A 18K rlFN-y homogén, és aminosav-öszszetétele a DNS szekvencia alapján várható összetételnek felel meg. A 15K és 18K rIFN-y aminosav-összetételét a 7. táblázatban tüntetjük feli Automata gázfázisú fehérje/peptid szekvencia meghatározó készülékben néhány száz pikomól redukált és karboximetilezett 15K és 18K fehérje Edman-bomlást szenved. A 15K és 18K fehérjék első 32 és 26 maradékának aminosav-N-terminális szekvenciái a DNS szekvencia alapján vártnak felelnek meg (2. ábra). A szekvencia analízis első és harmadik ciklusában 14C-karboximetilezett ciszteineket mutattunk be. N-terminális metionint nem mutattunk ki. A 18K és 15K rlFN-y N-terminális szekvencia analízise azt mutatja, hogy mindkét fehérje esetében e tartományok szekvenciája a DNS szekvencia alapján várttal azonos. A fenti tartományban fellépő esetleges kiesések vagy változások meghatározása céljából a C-terminális peptideket is jellemezzük. A karboxipeptidáz A (CPA) által megbontott elegy aminosav analízise azt mutatja, hogy a 18K rlFN-y-bó) szerin és/vagy glutamin (C-terminális aminosavak) szabadultnak) fel, ugyanakkor azonban azonos körülmények között a CPA a 15K rlFN-y-t nem bontja. Minthogy a Ser-Gin képezi a rlFN-i; C-terminális szekvenciáját, a 18K species intakt C-terminust tartalmaz, mig a 15K species esetében a C-terminális maradék (Lys) ettől eltérő és CPA nem bontja. A DNS-szekvencia alapján várható C-terminális maradékok további bizonyítása céljából a C-terminális peptideket CNBr-es kezelés után analízisnek és szekvencia-meghatározásnak vetjük aló. A C-terminális peptideket C18 fordított-fázisú oszlopon nagynyomású folyadékkromatográfiával választjuk szét (3. ábra). A 15K rlFN-y esetében a gradiens korai részéből eluálva erős peptid csúcsot (II. csúcs) nyerünk és ez a peptid a 18K rIFN-y CNBr-el történő megbontása után kapott keverékben nincs jelen. A fenti peptid aminosav-aruilizis alapján homoszerint vagy homoszerin-laktont nem tartalmaz és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
