196462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás imun interferon előállítására
16 196462 17 5. táblázat Monoklonikus anti-test al-osztály Antigén Anti-test Kicsapásos görbe Találmányunk szerinti monoklonális anti-test (Frakció 17) Anti-IgGl (Frakció 17) Anti-IgG2a(Frakció 17) Anti-IgG2b + (Frakció 17) Anti-IgG3-10. példa A 8. példa szerinti eljái'ással tisztított kifolyó frakciókból 25 ml (65,3 mg) monoklonális anti-testet egy éjjelen át 0,1 mólos nátrium-hidrogén-karbonáttal szemben (pH = 8,3) dializáljuk. Külön lombikban 25 ml AFFI-GEL 10-t (Bio-Rád) vízzel alaposan mosunk, üvegszűrő felhasználásával 0,1 mólos nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban szuszpendálva (pH = 8,3) és a fenti anti-testtel ők»:/«keverjük. Az elegyet 4 órán át 4 °C-on a reakció lejátszatása céljából enyhén keverjük, majd 4 °C-on egy éjjelen át állni hagyjuk. Az AFFI-GEL 10-t 0,1 mólos nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal (pH = 8,3) üvegszűrő alkalmazásával alaposan mossuk. A gélhez 25 ml, 0,1 mól etanol-amint és 0,15 mól nátrium-kloridot tartalmazó oldatot (pH = -8,0) adunk. Az elegyet 4 °C-on egy órán át rázatjuk a még visszamaradó reagálatlan aktiv csoportot blokkolása céljából. A gélt ezután PBS-el (foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldat; 0,01 mói/iiter koncentrációjú foszfát nátrium-kloridban, 8,5 g/1, pH = 7,0) mossuk és 25 ml, 0,1% nátrium-azidot tartalmazó PBS-ben szuszpendáljuk. A szuszpenziót 4 °C-on tároljuk. A hozzáadott anti-test és a szűrletben levő anti-test mennyisége alapján azt találtuk, hogy az anti-test 2,35 mg/ml gél arányban kötődik a gélhez. Anti-test oszlopként az ily módon kapott reakciótermékkel töltött oszlopot alkalmazunk. 11. példa Az rlFN-í termeléshez E. coli RRI törzset alkalmazunk (pRK148cIts, pRC231/IFI- 900) (e rekombináns organizmus szerkezetét a 99 084 sz. európai szabadalmi leírásban ismertették). A pRK248cIts és pRC231/IFI.900 plazmidok hőmérsékletre érzékeny Lambda-represszor és IFN-'X géneket tartalmaznak. Az rIFN-)f gének kifejezésre juttatása a Pl promoterrel való szabályozás alatt történik. A E. coli RRI törzs (pRK248clts, pRC231/IFI-900) egy éjszakás tenyészetét LB táptalajon 30 °C-on tenyésztjük. Az egyéjszakás tenyészet 1 literét kazamino-savakat 2o tartalmazó minimális M-9 táptalajjal 10 literre hígítjuk. A .kazamino-savak ’ kazein hidrolízisével nyert, a mikrobiológiában felhasznált aminosav-keverékek. A .minimális M-9 táptalaj" ugyancsak a mikrobiológiában használa- 2g tos táptalaj, amelynek összetétele a következő: dinátrium-hidrogén-foszfét 6 g/1; kálium-dihidrogén-foszfát 3 g/1; nátrium-klorid 0,5 g/1; ammónium-klorid 1 g/1; 1 mól/liter koncentrációjú magnézium-szulfát-oldat 30 2 ml/1; 1 mól/liter koncentrációjú kalcium-klorid-oldat 0,1 ml/1; 20%-os glükóz-oldat 0,1 ml/1; pH = 7,4. Logaritmus növekedés mellett a tenyészet hőmérsékletét 30 °C-ról 42 °C-ra növeljük, majd a tenyésztést 42 °C- 35 on 2-3 órán át folytatjuk. A baktériumokat centrifugálással összegyűjtjük és a baktérium-tartalmú labdacsokat felhasználásig -20 °C-on tároljuk. A frementáció és a feldolgozás minden műveletét a National Institu- 40 tes of Health rekombináns DNS irányelveivel összhangban végezzük el. A rlFN-u szintetikus 131-146. C-terminális peptidjeinek monoklonális anti-testjeit a fenti módszerrel készítjük el. A rIFN-K tisz- 45 títására Mo ■)( 2-11.1 monoklonális anti-testet alkalmazunk. A monoklonális anti-test-oszlopot a 10. példában leírtak szerint készítjük el. A rlFN-^ 14C-jód-ecetsavval történő 50 karboximetilezést 6 mól guanidin-hidroklorid jelenlétében, a (3) irodalmi helyen leírtak szerint hajtjuk végre. A reagens fölöslegét C-8 fordított fázisú oszlopon történő nagynyomású folyadékkromatografálással távolit- 55 juk el. A karboxipeptizádos bontást 0,2 mólos ammónium-karbonát-oldatban a (4) irodalmi helyen leírtak szerint végezzük el. A rlFN-'jj CNBr-el történő kezelését (metioninhoz viszonyítva 100-szoros moláris fó- 00 lösleg) 70%-os hangyasavban az (5) irodalmi helyen leírtak szerint végezzük el. A CNBr peptideket C-18 fordított fázisú oszlopon nagynyomású folyadékkromatografálással választjuk el. A peptid eluáiását 0 és 70% ko- 65 zötti mennyiségű metil-cianidot tartalmazó 10
