196462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás imun interferon előállítására
2 196462 3 Találmányunk tárgya eljárás immun interferon előállításéra. Találmányunk tárgya közelebbről eljárás rekombináns humán immun interferon intakt szekvencia formájának extrakciójára a fenti fehérjét magábanfoglaló transzformált mikroorganizmust tartalmazó készítményből. Az extrakciót olyan reagenssel (pl. guanidin-hidroklorid) végezzük el, amely a proteáz enzim-aktivitást gátolja, ugyanakkor azonban a kívánt fehérje aktivitását nem befolyásolja. A guanidin-hidrokloriddal történő extrakció után következő tisztítási lépések a fehérjék tisztításában járatos szakember számára jól ismertek. Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábrán tisztított rekombináns humán immun interferon nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gél elektroforézisét (a továbbiakban SDS-PAGE) mutatjuk be reduktív (A; 0,7 mól /3-merkapto-etanol) és nem redukáló (B) körülmények között. A 2. ábrán a rekombináns humán immun interferon várható aminosav-frekvenciáját a 15K és 18K rIFN-í species tényleges DNS szekvenciájával hasonlítjuk össze. A 3. ábrán a 15K és 18K rlFN-^ C-terminális peptidjeinek HPLC elválasztását mutatjuk be CNBr kezelés után. Az irodalomban számos módszert ismertettek az interferon néven ismert virus-ellenes fehérje-család extrakciójára és tisztítására. Jelen ismereteink szerint három főbb interferon-tipust különböztetünk meg: IFN-oc (leukocita), IFN-/3 (fibroblaszt) és IFN-H (immun). Bár a különböző interferon-típusok vírus-ellenes és burjénzásgátló hatásuk vagy szerkezeti felépítésük alapján összefüggnek, az irodalomban eddig egyetlen egységes módszert sem ismertettek mindhárom interferon-tipus extrakciójára és tisztítására. A leukocita-interferonnak más fehérjéket és sejtmaradványokat tartalmazó nyers keverékből történő extrakciójára és tisztításéra felhasználható módszerek valójában nem alkalmasak fibroblaszt vagy immun interferonnak ugyanezen készítményből történő extrakciójára és tisztítására. Az ismert tisztítási eljárások extrakciós lépése során a mikroorganizmust mechanikus (azaz s2onifikáció) vagy kémiai lizisnek vetették alá, amelynek sorén - gyakran rekombináns módszerek ütjén - nyerték a kívánt .idegen* fehérjét. A mechanikai vagy kémiai lízis-módszerek során azonban a keverékbe különböző sejt-proteázok is belekerülnek. E proteázok ezután enzimes behatás révén lebonthatják a keverékben levő .idegen' fehérjét. E proteázok ezért megakadályozhatják vagy gátolhatják az .idegen" fehérje teljes vagy érett és biológiailag aktív formájának homogén szintig történő tisztítását. Találmányunk célkitűzése az ismert extrakciós módszerek hátrányainak kiküszöbölése és immun interferon intakt szekvenciájának előállítására, amelynek során a proteolitikus lebontásból származó fragmenseket a tisztított immun interferon készítményből eltávolítjuk. A találmány előnyös foganatositási módjainak ismertetése: Azt találtuk, hogy immun interferon esetében a szokásos extrakciós módszerekkel (pl. az irodalomban leírt szonifikáció vagy mechanikai lízis) nem nyerhető intakt vagy teljes aminosav-szekvencióval rendelkező immun interferon. A rekombináns technológia csupán a közelmúltban ért el olyan fejlettségi fokot, amelynek segítségével a jellemzéshez és aminosav-szekvencia meghatározáshoz elegendő mennyiségű rINF-K állítható elő. Az rlNF-ij készítmények szokásos módszerekkel történő extrakciója és a tisztított anyag amínosav-szekvenciájának meghatározása során azt találtuk, hogy a tisztított készítmény többfajta különböző molekulatömegü fehérje-speciest tartalmaz. Az aminosav-szekvencia meghatározása azt mutatta, hogy ezek a fehérje-speciesek ténylegesen az immun-interferon intakt szekvencia formájának az intakt szekvencia fehérjék proteolitikus fragmentjeivel képezett kombinációjából állnak. Az ismert eljárásokkal tehát nem extrahálható és tisztítható az immun interferon más proteolitikus fragmenseitöl mentes homogén immun interferon. Azt találtuk, hogy a rlFN--); bomlása meggátolható olyan reagenssel (pl. guanidin-hidroklorid) amely a proteáz vagy enzim aktivitást gátolja, ugyanakkor azonban a tisztítási eljárás kezdeti extrakciós lépésben a rlFN-'s aktivitást nem befolyásolja és ily módon homogén és intakt molekulák nyerhetők. A fagyasztott sejtek guanidin-hidroklorid távollétében történő szonífikációja során főként olyan proteolitikus terméket kapunk (15K iTFN-k), amelyben a IFN-^ 132-146. sz. C-terminélis aminosav-maradékai hiányoznak. Az intakt molekula amínosav-összetétele és N-terminális szekvenciája a DNS-szekvencia alapján várhatónak felel meg. A rlFN-'tf DNS-bázis szekvenciája az 1. számú irodalmi helyen került ismertetésre és a leírásban erre hivatkozunk. Meglepő módon azt találtuk, hogy az immun interferon biológiai aktivitását a guanidin-hidrokloridos extrakciós lépés után is megtartja annak ellenére, hogy az immun interferon tisztított mintájához adott guanidin-hidroklorid a biológiai aktivitást tönkreteszi. A találmányunk .szerinti eljárás előnyös foganatositási módja szerint a transzformált mikroorganizmusokat gaunidin-hidrokloridban szuszpendáljuk. f. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
